缺氧性視網(wǎng)膜病變患者血及玻璃體中NO和VEGF濃度的變化

1、缺氧性視網(wǎng)膜病變患者血及玻璃體中NO和VEGF濃度的變化     【摘要】  目的：檢測(cè)一氧化氮(nitric oxide,NO)在缺氧性視網(wǎng)膜病變患者的玻璃體和血中的濃度變化，并與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)相比較，從而闡明兩者的關(guān)系。方法：增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)16例，視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞5例，孔源性視網(wǎng)膜脫離11例和黃斑裂孔10例。抽取患者血液，并于玻璃體切除手術(shù)中抽取玻璃體。Gr

2、iess反應(yīng)檢測(cè)NO的濃度，ELISA檢測(cè)VEGF的濃度。結(jié)果：玻璃體中NO濃度在PDR組中明顯升高(15.2，4.650.9mol/L)，與其他3組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0046);血液中的NO濃度在4組中無(wú)明顯差異。玻璃體中的VEGF濃度在PDR(1507.2，50.73722.0mg/L)和BRVO(838.8，212.7850.6mg/L)組中均明顯升高，與其他兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0008)，而PDR組又高于BRVO組(P=0.001);各組病例血液中VEGF濃度無(wú)明顯差異(P=0.76)。4組病例中，NO和VEGF間均未見(jiàn)相關(guān)性。結(jié)論：NO和VEGF在PDR組的玻璃

3、體中均明顯升高，表明二者參與了糖尿病視網(wǎng)膜新生血管生成的過(guò)程。 【關(guān)鍵詞】  一氧化氮;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;玻璃體Nitric oxide and VEGF expression in the ischemichypoxic retinopathyQiong Zhang1, ShiSheng Zhang2, Yan Yan1, YanHong Yao1, Xi Shen1, YingMing Zhou1, CaiHong Zhu1, JianMin Xu11Department of Ophthalmology, Ruijin Hospital of Shanghai Jiaotong

4、 University School of Medicine, Shanghai 200025, China;2New Vision Eye Clinic, Shanghai 200025, ChinaAbstractAIM: To evaluate the expressions of nitric oxide (NO) and VEGF in vitreous humor and blood samples in patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and in patients with branch retina

5、l vein occlusion (BRVO) and to compare the levels with those of controls.METHODS: NO concentrations were determined using the Greiss reaction in plasma and vitreous humor samples. VEGF levels were assayed by ELISA. The patients in the studies were divided into four groups: 16 patients with PDR, 5 pa

6、tients with BRVO, 11 patients with rhegmatogenous retinal detachment and 10 patients with macular hole.RESULTS: The vitreous fluid levels of NO were significantly higher in patients with PDR than those in other three groups (15.2，4.650.9mol/L, all P<0.01). The concentration of VEGF were significa

7、ntly higher in patients with PDR and BRVO than other two groups(P=0.0008，1507.2，50.73722.0mg/L; 838.8，212.7850.6mg/L respectively), but highest in PDR(P=0.001). There was no significance with NO and VEGF in serum in four groups. There was no correlation with that of NO and VEGF in four groups whatev

8、er in vitreous or plasma.CONCLUSION: The results suggest that higher levels of NO and VEGF may be related to the angiogenesis in DR.KEYWORDS: nitric oxide; VEGF; vitreous0引言隨著人民生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及早產(chǎn)兒成活率的提高，缺氧性視網(wǎng)膜病變，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等一些原本不受重視的眼底疾病已逐漸成為人們致盲的主要原因。缺氧性視網(wǎng)膜病變的共同病理改變表現(xiàn)為新生血管形成及血管過(guò)度化生。

9、研究表明，在新生血管生成過(guò)程中，有諸多細(xì)胞因子參與其中。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種高度特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，它是目前公認(rèn)與新生血管過(guò)度增生相關(guān)的重要因子。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種重要的信使分子和生物活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體一系列生理活動(dòng)1。有研究表明，在血管生成過(guò)程中，NO也參與了這個(gè)過(guò)程，并且和VEGF是起到相輔相成的作用。我們檢測(cè)在缺氧性視網(wǎng)膜病變的患者眼中VEGF和NO濃度的變化，從而進(jìn)一步證實(shí)NO和VEGF促新生血管生成的作用。1材料和方法1.1材料 200805/20091

10、0行玻璃體切除手術(shù)42例患者，其中增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)16例;視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion, BRVO)伴玻璃體出血5例;孔源性視網(wǎng)膜脫離11例;黃斑裂孔10例?；颊呒韧鶡o(wú)手術(shù)史、外傷史。玻璃體出血的時(shí)間均在3mo以上。其中PDR患者僅有玻璃體出血而無(wú)視網(wǎng)膜脫離。BRVO者也是單純玻璃體出血的患者。所有患者術(shù)前空腹抽取靜脈血，隨即在4下離心(15 000r/min)5min，提取上清液，置80低溫冰箱保存。患者在行玻璃體手術(shù)前，抽取術(shù)眼的未稀釋的玻璃體液體1m

11、L，隨即離心15 000r/min，5min，提取上清液，置80低溫冰箱保存。1.2方法 用Griess法測(cè)定標(biāo)本中NO的含量。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)樣本中的VEGF的濃度。樣本中的VEGF與酶標(biāo)板上的抗人VEGF單抗結(jié)合，再與結(jié)合有生物素的抗人VEGF抗體結(jié)合，經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，與酶底物反應(yīng)染色，在450nm測(cè)定與VEGF濃度相對(duì)應(yīng)的A值。以標(biāo)準(zhǔn)品的A值畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品A值在該曲線圖上查出相應(yīng)的VEGF含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多樣本均數(shù)方差分析及兩兩比較。P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1 N

12、O濃度 玻璃體中NO濃度在PDR組中明顯升高(15.2，4.650.9mol/L)，與其他3組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.13，P=0.0046);血液中的NO濃度在四組中無(wú)明顯差異(F=1.13，P=0.35)。2.2 VEGF濃度 玻璃體中的VEGF濃度在PDR(1507.2，50.73722.0mg/L)和BRVO(838.8，212.7850.6mg/L)組中均明顯升高，與其他兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.84，P=0.0008)，而PDR組又高于BRVO組(t=3.92，P=0.001);各組病例血液中VEGF濃度無(wú)明顯差異(F=0.38，P=0.76)。在各組病例中，NO和VEG

13、F均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性。3討論NO是一種半衰期僅為數(shù)秒鐘的自由氣體，作為一種重要的信使分子和生物活性物質(zhì)，NO參與調(diào)節(jié)機(jī)體的一系列生理活動(dòng)，其中還涉及新生血管生成等病理過(guò)程1。已有研究表明NO在血管生成中起著促進(jìn)或抑制作用。我們采用Griess法檢測(cè)了糖尿病視網(wǎng)膜病變等患者玻璃體和血清中NO的濃度。結(jié)果顯示在血清中NO的濃度在四組中無(wú)明顯差別(F=1.13，P=0.35)。而在玻璃體中在PDR組中明顯升高，與其它3組相比有臨床意義(F=5.13，P=0.0046)。因此證實(shí)了NO在糖尿病視網(wǎng)膜病變中新生血管形成過(guò)程中起著促血管的作用。這與Hernández的研究結(jié)果相同2。視網(wǎng)膜分支靜

14、脈阻塞也是一種缺氧性視網(wǎng)膜病變，而我們沒(méi)有檢測(cè)到NO的濃度明顯升高，可能是由于臨床標(biāo)本量太少，所以沒(méi)有檢測(cè)到。在血液中4組NO的濃度沒(méi)有明顯差異，提示玻璃體中NO并不是來(lái)源于血中NO的彌散。NO合成需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化?，F(xiàn)已知至少有3種獨(dú)立基因編碼的NOS催化NO合成。神經(jīng)元型NOS(nNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)是結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive NOS)，主要參與神經(jīng)介質(zhì)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)血管張力等過(guò)程3;誘導(dǎo)型NOS(iNOS)主要表達(dá)于細(xì)胞因子或內(nèi)毒素激活的巨噬細(xì)胞，所催化產(chǎn)生的NO是炎癥和感染過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)物質(zhì)4

15、。在眼科領(lǐng)域，研究已經(jīng)證明，內(nèi)源性NO不僅是眼循環(huán)中有力的血管擴(kuò)張劑，而且是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的前葡萄膜炎的重要媒介物，并與青光眼的發(fā)病機(jī)制有一定關(guān)系。iNOS在健康的組織內(nèi)一般不表達(dá)或呈低表達(dá)，只有當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病理情況下才大量表達(dá)。關(guān)于iNOS在血管形成方面的作用說(shuō)法不一。iNOS抑制血管形成，而有的報(bào)道結(jié)果相反5，6。Hattenbach等7在老年性黃斑變性的患者中發(fā)現(xiàn)iNOS在脈絡(luò)膜新生血管形成中具有舉足輕重的地位。我們先前研究在OIR模型中也發(fā)現(xiàn)iNOS在缺氧2h時(shí)表達(dá)尤為明顯，6h時(shí)開(kāi)始下降，24h時(shí)回到接近正常水平。這提示了在缺氧早期，iNOS與VEGF一樣立即出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，是嗣后啟動(dòng)

16、視網(wǎng)膜新生血管生成的早期分子事件，一定程度地促進(jìn)了新生血管形成。并且通過(guò)運(yùn)用抑制劑，進(jìn)一步證明了iNOS作為促新生血管因子在視網(wǎng)膜新生血管中發(fā)揮作用8。由于在玻璃體中無(wú)法檢測(cè)到iNOS的濃度，只能間接檢測(cè)NO的濃度來(lái)證實(shí)其在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用。VEGF是公認(rèn)的促血管生成因子。我們發(fā)現(xiàn)，各組病例血液中VEGF濃度無(wú)明顯差異(P=0.76)。玻璃體中的VEGF濃度在PDR組(1507.2mg/L)和BRVO(838.8mg/L)組中均明顯升高，與其他兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0008)。提示了在缺氧性視網(wǎng)膜病變中VEGF的確是起到了促血管生成的作用。有很多研究也證實(shí)了這個(gè)結(jié)果2，9。

17、我們的結(jié)果進(jìn)一步顯示，在PDR組中VEGF的濃度明顯高于BRVO組的濃度(P=0.001)。這有可能有幾種原因：(1)BRVO組的樣本量太少;(2)VEGF在促新生血管形成中的作用大于NO的作用。這還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。在血管形成中NO和VEGF是密切相關(guān)的10。一方面，NO可以調(diào)節(jié)VEGF的合成：NO對(duì)VEGF的調(diào)節(jié)取決于NO產(chǎn)生數(shù)量的多少，少量的NO通過(guò)PI3KAkt通路上調(diào)VEGF的表達(dá)，其間也要通過(guò)HIF1和/或HO1調(diào)節(jié)通路;而大量的NO則抑制VEGF的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不明了。另一方面，VEGF可以介導(dǎo)NO的合成：VEGF通過(guò)CaMAkt通路迅速合成NO;而NO延遲合成主要是通過(guò)

18、PKC的激活。但是我們的研究結(jié)果未找到VEGF和NO有聯(lián)系。這有可能和NO的樣本量較少有關(guān)或者是VEGF主要在玻璃體內(nèi)合成有關(guān)。我們的研究結(jié)果證實(shí)，NO和VEGF在缺氧性視網(wǎng)膜病變患者的玻璃體中均明顯升高，尤其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，提示了兩者參與了視網(wǎng)膜新生血管形成的過(guò)程?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 WilkinsonBerka JL. Vasoactive factors and diabetic retinopathy: vascular endothelia growth factor, cycoloxygenase2 and nitric oxide. CurrPharm Des 2

19、004;10(27):333133482 Hernández C, Lecube A, Segura RM, et al. Nitric oxide and vascular endothelial growth factor concentrations are increased but not related in vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy. Diabet Med 2002;19:6556603 Montgomery HJ, Bartlett R, Perdicakis

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