柱層析和薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、柱層析和薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告篇一：柱層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告柱層析分離色素一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解柱層析的分類，掌握各種柱層析的原理。2熟練掌握吸附層析的原理和操作技術(shù)。二、【實(shí)驗(yàn)原理】 葉綠體色素是植物吸收太陽(yáng)光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要有葉綠素a、葉綠素 b、 胡蘿卜素和葉黃素組成。從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對(duì)其認(rèn)識(shí)和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機(jī)溶劑的特性，可用 95%乙醇或無(wú)水乙醇提取。 分離色素的方法有多種，如紙層析、柱層析等。柱層析法是色譜法中的一種，它是根據(jù) 混合物中各組分對(duì)固定相的吸附能力，以及對(duì)洗脫劑（即移動(dòng)相）的溶解度不同將各組分分離。常用的柱色譜有吸附色柱譜和分配柱色譜兩

2、類。 吸附柱色譜通常是在玻璃管中填入表面積很大， 經(jīng)過(guò)活化的多孔性物質(zhì)或粉狀固體作為吸附劑 （如氧化鋁或硅膠） ，當(dāng)混合物的溶液流經(jīng)吸附柱時(shí)，就被吸附在柱的上端，然后從柱頂加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶劑中的溶解度也不同，因此各組分隨 溶劑以不同速度下移， 形成色帶。 繼續(xù)用溶劑洗脫， 吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先流出， 整個(gè)層析過(guò)程進(jìn)行反復(fù)的吸附 -解析-再吸附 -再解吸。用柱層析法可以分別收集各組分， 并 逐個(gè)鑒定。 本實(shí)驗(yàn)是把三氧化二鋁填入玻璃管中（壓成柱狀）作為吸附劑，將葉綠 體色素的石油醚提取液傾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的種類不同

3、，被吸附的強(qiáng)弱不 同，就在吸附柱上排列成為不同的色層，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力，用不 同的溶劑進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到葉綠體主要的 4 種色素（葉綠素 a、葉綠素 b、葉黃素、胡蘿卜 素）的分離。三、【實(shí)驗(yàn)材料】原料：新鮮的菠菜葉試劑 ：1 無(wú)水乙醇或 95%乙醇 5. 三氧化二鋁2 石英砂 6 飽和氯化鈉溶液3 丙酮 7. 水硫酸鈉4 石油醚（ 60-90 ） 8 洗脫液：丙酮：石油醚 1：9 器材 ：層析柱（ 1× 30cm），研缽，蒸餾裝置，脫脂棉， 天平， 燒杯，過(guò)濾漏斗，玻璃棒，錐形瓶，分液漏斗，試管 ，鐵架臺(tái)四、【實(shí)驗(yàn)操作】1色素的提?。?0 克菠菜，加少許石英砂

4、，再加 20 毫升無(wú)水乙醇研磨成漿，脫脂棉過(guò)濾，保 存濾液，濾渣再用無(wú)水乙醇提取一次，合并濾液，濾渣再加入30 毫升石油醚提取一次，過(guò)濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中 , 再加入 40 毫升飽和氯化鈉溶液震蕩，棄去下層溶液， 再分別加入 20毫升水震蕩洗滌幾次，直至下層無(wú)色，保留上層溶液，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入 無(wú)水硫酸鈉干燥 5 分鐘，備用 .2樣品的濃縮：將提取液放入蒸餾燒瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液體 5-8 毫升左右，以 備加樣使用。3層析拄的制備：15克堿性三氧化二鋁加入 30毫升石油醚攪拌，浸泡 10min. 。在層析拄內(nèi)加入一團(tuán)棉花在底部，再加入石英砂 0.5cm 以上，然后用石

5、油醚半充滿 柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時(shí)應(yīng)該緩慢，重復(fù)使用下面的石油醚，直 到裝完。用石油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團(tuán)棉花，然后再填入石英砂 0.5 厘米高。3樣品的分離層析：吸附層析分離色素打開(kāi)層析拄下部開(kāi)關(guān)，向拄內(nèi)加入 2毫升濃縮液，至液體沒(méi)入砂內(nèi)， 再加入石油醚沖洗拄壁，液體浸入砂內(nèi)，加洗脫液 開(kāi)始層析，可以看到不同色帶如圖片1，直至第一條色帶洗脫完畢， 在拄下面用試管接收第一條色帶的洗脫液， 如圖 片 2 。五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖： 圖一：層析柱中出現(xiàn)黃色帶 圖二：提取出的黃色胡蘿卜素 結(jié) 果分析：洗脫過(guò)程中，首先有一條黃色的色帶圈沿著層析柱下移，色帶圈的各個(gè)方向的

6、移動(dòng)速度并不是完全相同，原因在于層析柱的制作過(guò)程并不完全均一，使層析柱內(nèi)部不 均勻，以至于色帶各方向的移動(dòng)速度不同。最后收集得到亮黃色的胡蘿卜素。七、【注意事項(xiàng)】1、萃取時(shí)不要?jiǎng)×艺袷帲苑乐拱l(fā)生乳化現(xiàn)象。2、為了保持柱子的均一性， 使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的， 否則 當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí)，就會(huì)使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整 個(gè)裝樣過(guò)程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面3、在吸附劑上端加入脫脂棉（或?yàn)V紙）是使加樣品時(shí)不致把吸附劑沖起；在吸 附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附劑細(xì)粒流出。4、層析柱填裝緊密與否，對(duì)分離效果很有影響，若各部分松緊不勻，會(huì)影響滲 透速度和

7、顯色的均勻。6、洗脫流速不宜過(guò)快，避免因此壓緊凝膠，色素分離不開(kāi)；也不要過(guò)慢，使柱 裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降，色素洗脫很慢。因此應(yīng)控制洗脫流速，以 每分鐘 6080滴為宜。7、樣品一定要足夠濃縮，加樣量不要過(guò)大，過(guò)大，分離條帶過(guò)寬，如果層析拄 不夠長(zhǎng)，各組分不易分開(kāi)，易同時(shí)洗脫下來(lái)；加樣量過(guò)少，色帶不是很清楚，不易觀察， 效果不好。8、層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng)的柱 分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑 太小時(shí)，會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)” ，即柱管中心部分的組份移動(dòng)慢， 而管壁周?chē)囊苿?dòng)快。 柱越長(zhǎng)， 分離效果

8、越好，但柱過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。八、【實(shí)驗(yàn)小結(jié)】在該柱層析分離色素實(shí)驗(yàn)中，我了解了柱層析技術(shù)的相應(yīng)方法和原理，學(xué)會(huì)了 層析柱的制作和準(zhǔn)備，進(jìn)一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)、洗脫液的 配比、層析柱的制作及洗脫液的流速是本實(shí)驗(yàn)成功與否的三大關(guān)鍵因素。 知識(shí)拓展：1、溶劑的選擇：（1）吸附劑要求較純，否則會(huì)影響樣品的吸附和洗脫。（ 2）溶劑和吸附劑不能起化學(xué)反應(yīng)。（3）溶劑的極性應(yīng)比樣品小，如果大了，樣品不宜被吸附劑吸附。（ 4）溶劑對(duì)樣品的溶解度不能太大，否則影響吸附，但也不能太小，溶液的體 積增加，易使色譜分散。（ 5）可使用混合溶劑， 如有的組分含有較

9、多的極性基團(tuán)， 在極性小的溶劑中溶 解度太小。也可選用極性大的溶劑溶解，然后加入一定量的非極性溶劑。這樣既降 低了極性，又減少了溶液的體積。2、洗脫劑的選擇：樣品吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進(jìn)行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑。如 果原來(lái)用于溶解樣品的溶劑沖洗柱不能達(dá)到分離的目的，可以改用其他溶劑，一般極性較強(qiáng)的溶劑影響樣品和氧化鋁之間的吸附， 容易將樣品洗脫下來(lái)， 達(dá)不到分離的目的。 因此 常用一系列極性漸次增強(qiáng)的溶劑，既先使用極性最弱的溶劑，然后加入不同比例的極性溶劑配成洗脫溶劑。 常用的洗脫溶劑的極性按如下次序遞增。 己烷和石油 醚環(huán)己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯

10、丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。篇二：實(shí)驗(yàn)六：薄層層析與柱層析 實(shí)驗(yàn)六 薄 層層析與柱層析 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解偶氮苯的光學(xué)異構(gòu)反應(yīng)，加深對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的理解。2. 掌握薄層層析的基本操作 , 薄層層析分離順、反式偶氮苯。3. 了解柱層析分離有機(jī)化合物的原理， 初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作方法4. 采用柱層析分離反式偶氮苯與靛紅的混合物 實(shí)驗(yàn)原理 偶氮苯是最簡(jiǎn)單 的芳香偶氮化合物，眾多偶氮染料的母體結(jié)構(gòu)。含有兩個(gè)苯基分別與偶氮基 n=n兩端相連的結(jié)構(gòu)。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有順（ z）- 反（e）- 異構(gòu)體。反式為橙紅色棱形晶體，蒸氣為深紅色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的熱力 學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)溶

11、于乙醇的偶氮苯用一定強(qiáng)度的紫外光照射時(shí)，順式的比例逐漸增大，直至 達(dá)到平衡，形成順?lè)串悩?gòu)體的混合物。偶氮苯的光致異構(gòu)是很多偶氮類功能材料光響應(yīng)的基 礎(chǔ)。順式為橙紅色片狀晶體，不穩(wěn)定，在加熱或可見(jiàn)光照射下能夠變成反式。色譜方法是通 過(guò)在固定相和流動(dòng)相間分配的不同而將物質(zhì)分離開(kāi)。待分離混合物各組分在固定相上的吸附強(qiáng)度不同， 與流動(dòng)相一起移動(dòng)的速度也不同， 因此被分離開(kāi)。 薄層色譜屬于固 - 液吸附色譜。薄層色譜板中的固定相中的微孔結(jié)構(gòu)使得溶劑在毛細(xì) 管作用下能夠沿著色譜板向上移動(dòng)。由于混合物中各組分對(duì)吸附劑（固定相）的吸 附能力不同，當(dāng)展開(kāi)劑（流動(dòng)相）流經(jīng)吸附劑時(shí)發(fā)生無(wú)數(shù)次吸附解附過(guò)程，吸附力弱的

12、組分 隨流動(dòng)相迅速向前移動(dòng)，吸附力強(qiáng)的組分滯留在后，由于各組分具有不同的移動(dòng)速度，最終 在固定相薄層析上分離。 tlc 除了用于分離外，還可以通過(guò)與已知結(jié)構(gòu)的的化合物比對(duì)，鑒定少量有機(jī)混合物的組成，它也是柱色 譜尋求最佳展開(kāi)劑的手段。上圖中紅色化合物的 rf 等于豎直紅線的長(zhǎng)度除以豎直藍(lán)線的長(zhǎng) 度。柱層析也屬于固 - 液吸附色譜。在一根玻璃“分離柱”中進(jìn)行。管中裝上適當(dāng)?shù)?粉末作為國(guó)定相。待分離或純化物質(zhì)的溶液（流動(dòng)相）在重力作用下流經(jīng)吸附劑時(shí)，不 同物質(zhì)對(duì)溶劑和吸附劑的親和力不同，因而被吸附的程度不同，從而以不同速度流動(dòng)，使化 合物得以分離。靛紅與偶氮苯在極性上具有較大差異，從而可以使用極性

13、適中的展開(kāi)劑，通過(guò) 柱層析將二者分離。儀器與試劑分析天平， tlc ，錐形瓶，毛細(xì)管，層析柱，棉花，量筒，硅膠，蒸發(fā)皿，展缸； etoac,ch2cl2, 石油醚，靛紅；請(qǐng)自帶尺子(用于計(jì)算 rf 值) 顏老師在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之 前已經(jīng)準(zhǔn)備好的試劑： a. 偶氮苯的溶液( 15 mg in 1ml etoh )； b.靛紅的溶液( 15 mg in 1ml ch2cl2 )；c. 靛紅與偶氮苯的均勻混合物(靛紅 1.4 g + 偶氮苯 3.5 g )。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容a) 光照異構(gòu)化取 0.1 g 反式偶氮苯溶于 5 ml 無(wú)水乙醇中，將此溶液放于試管中，密封，置于 可見(jiàn)光下二星期，以便與光照前的溶液進(jìn)行對(duì)

14、比。 b) 薄層層析取管口平整的毛細(xì)管吸取光照后的偶氮苯溶液， 在離薄層板邊沿約 0.5 cm的起 點(diǎn)線上點(diǎn)樣。再用另一毛細(xì)管吸取未經(jīng)光照的反式偶氮苯溶液點(diǎn)樣。待乙醇揮發(fā)后，將 點(diǎn)好樣品的薄層板放入內(nèi)襯濾紙的展缸中。展缸內(nèi)已放置展開(kāi)劑(乙酸乙酯/石油醚 =1/40 )。薄層板的點(diǎn)樣端在下方，浸入展開(kāi)劑，展開(kāi)劑不要沒(méi)過(guò)起點(diǎn)線，也不要碰到樣品點(diǎn)。待展開(kāi) 劑前沿上升到離板的上端約 1 cm 處時(shí)，取 出薄層板，立即用鉛筆在展開(kāi)劑上升的前沿處劃 一記號(hào)，置于空氣中晾干?？捎^察到薄層板上經(jīng)光照后的偶氮苯溶液點(diǎn)樣處上端有兩個(gè)黃色斑點(diǎn)（哪一個(gè)斑點(diǎn)是順式 的？哪一個(gè)斑點(diǎn)是反式的？） 。計(jì)算異構(gòu)體的 rf 值。

15、 用上述相同的方法， 采用 ethyl acetate : petroleum ether = 1:1為展開(kāi)劑，對(duì)靛紅與偶氮苯的混合物進(jìn)行 tlc ，為下面的柱層析選擇展開(kāi)劑。 c） 柱層析1將層析柱固定在鐵架臺(tái)上，一定要保持柱子豎直。2將層析柱洗凈后在柱底部放入一小團(tuán)脫脂棉花。3在錐形瓶中稱重 7g 硅膠（ sio2 ），并用 ethyl acetate : petroleum ether （1:40） 調(diào)勻。在層析柱的下方放置一個(gè)錐形瓶，以收集流下的液體。加入少量洗脫 劑于層析柱中，以潤(rùn)濕棉花，使其貼在柱子下端。4打開(kāi)層析柱活塞，控制溶劑下流，將硅膠懸濁液沿柱子側(cè)壁加入，并用少量的溶劑洗去

16、殘余的硅膠，并加入柱中。用裝有橡皮管或塞子由下向 上輕輕敲擊 柱子外壁，將氣泡趕出，使硅膠填裝均勻。并加壓使硅膠緊 密，以獲得較好的分 離效果。輕輕敲擊，使硅膠最上層成均勻平面，然 后用藥匙沿柱子側(cè)壁，輕輕地、 慢慢地在硅膠表面覆蓋一層海砂（注意：不要破壞硅膠的上平面）。關(guān)閉活塞，備用。5打開(kāi)活塞，當(dāng)溶劑液面降至海砂表面時(shí)，關(guān)閉活塞。用滴管沿柱子側(cè)壁加入靛紅與偶氮苯混合物的溶液（稱取 40 mg ，置于 1.5ml 的塑料樣品管，加入 1 ml 二氯甲烷（ ch2cl2 ），超聲振蕩使其溶解） 。打開(kāi)活塞，使溶劑液面降至海砂表面， 關(guān)閉活塞。再用少量的展開(kāi)劑洗塑料樣品管，加入層析譜中，并注意洗

17、去粘附在柱壁上的液滴，打開(kāi)活塞，流到液面，關(guān)閉活塞。重復(fù)上述操作，直到將所有化合物沖到硅膠里面。6沿側(cè)壁加入大量的洗脫劑 ethyl acetate : petroleum ether (1:40)，打開(kāi)活 塞，加壓保持一定的流速，觀察色帶的形成和分離。7當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí)， 并且沒(méi)有流出之前， 關(guān)閉活塞， 倒空錐形 瓶， 打開(kāi)活塞，收集全部色帶。然后，改用 ethyl acetate : petroleum ether (1:1)作為洗脫劑。關(guān)閉活塞，換一個(gè)空的且干凈的錐形瓶，打開(kāi)活塞。 當(dāng)?shù)诙€(gè)有 色帶到達(dá)柱底時(shí)，并且沒(méi)有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形 瓶，打開(kāi)活塞，收集 全部色帶。柱

18、層析分離結(jié)束。8柱層析分離結(jié)束后， 采用 tlc 對(duì)上述分離的兩個(gè)溶液進(jìn)行分析， 總結(jié)分 離 效果。同時(shí)，打開(kāi)層析柱活塞，在加壓下讓展開(kāi)劑流干，然后將硅膠 倒入指定的 固體廢物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。 預(yù)習(xí)時(shí)的問(wèn)題1. 在薄層層析實(shí)驗(yàn)中，為什么點(diǎn)樣的樣品斑點(diǎn)不可浸入展開(kāi)劑的溶液中？為什 么進(jìn)行薄層層析時(shí)展缸要蓋上蓋？2. 當(dāng)用混合物進(jìn)行薄層層析時(shí)，如何判斷各組分的在薄層板上的位置？靛紅與 偶氮苯，哪一個(gè)的極性較強(qiáng)？為什么？3. 柱層析時(shí)柱中若留有空氣或者是填裝不均勻，對(duì)分離效果有何影響？如何避 免？4. 偶氮苯和靛紅物理化學(xué)性質(zhì)？毒性？有什么應(yīng)用？偶氮苯光照異構(gòu)化的機(jī) 理？ why i

19、strans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它閱讀材料1. 光化學(xué)由光的作用引起的化學(xué)反應(yīng)近年來(lái)日益受到人們的重視，光合作用就是最重要 的光化學(xué)反應(yīng)。研究激發(fā)態(tài)分子化學(xué)行為的光化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)成為有機(jī)化學(xué)的一個(gè)重要分 支。光不僅可以引起多種多樣的化學(xué)反應(yīng)，合成各種前所未有的奇妙反應(yīng)分子，而且與我們 的日常生活及生命現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系。2. 薄層色譜1. 固定相的選擇氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜常用的固定相。氧化鋁多用于分離堿性或中性有 機(jī)物；而硅膠的吸附性源于表面的 si-oh 基，主要用于分離酸性、 中性有機(jī)物質(zhì)。 薄層 色譜用的硅膠有薄層

20、色譜用的硅膠有 60g、6ogf254 、60h、60hf254 和 60hf254+366等類型，其中 g表示含有 13硫酸鈣（作為黏合劑） ；h 表示不含硫酸鈣； f254 表示含有 2無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，在 254 nm的紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。與硅膠相似，氧化鋁 也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁 h、氧化鋁 g、氧化鋁 hf254 和氧化鋁 gf254 等類型。 黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉、羧甲基纖維素cmc）。2. 操作方法 點(diǎn)樣在薄層板一端約 1cm 處，用鉛筆輕輕劃一條作為起點(diǎn)線。樣品用易揮發(fā)性溶劑 溶解后，用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸到起點(diǎn)線的某一位置上。如果溶液太稀，可 多

21、點(diǎn)幾次，但要等第一次樣品溶劑揮發(fā)后，再點(diǎn)第二次。點(diǎn)好樣品后，待溶劑揮發(fā)干凈，才 可以進(jìn)行下面的展開(kāi)過(guò)程。 展開(kāi)劑的選擇選擇展開(kāi)劑，首先應(yīng)考慮對(duì)被分離物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅膠和 氧化鋁都是極性吸附劑，所以展開(kāi)劑的極性越大，試樣在薄板上移動(dòng)的距離越遠(yuǎn)， rf 值 （ rf 值是一個(gè)化合物在薄層板上上升的高度與展開(kāi)劑上升的高度的比 值）越大。例如，在 分離過(guò)程中常發(fā)現(xiàn) rf 太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性不夠，需要考 慮加入一種極性強(qiáng)的展 開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。發(fā)現(xiàn) rf 值太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性不夠， 需要考慮加入一種極性強(qiáng) 的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。常用展開(kāi)劑的洗脫力由小到大的順序?yàn)椋菏兔选h(huán)己烷、四 氯化碳

22、、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、 有機(jī)酸等。此外，在展開(kāi)過(guò)程中，展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)劑的蒸氣須始終處于飽和狀態(tài)。一 般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上 （下端浸于展開(kāi)劑中） ，蓋好密封一段時(shí)間。 取放薄層板應(yīng)迅速。顯色篇三：柱層析知識(shí)總結(jié) 柱層析知識(shí)總結(jié)小木蟲(chóng) （ 金幣+1）: 獎(jiǎng)勵(lì)一下，鼓勵(lì)發(fā)有價(jià)值的話題 篇二：氨基酸的薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 姓 名： XXXXX 學(xué) 號(hào)： XXXXXXXXXXXXXX 專業(yè)年級(jí)： XXXXXXXXXXXXXXX 組 別： 第 X 實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 實(shí)驗(yàn)名稱 實(shí)驗(yàn)日期 XXXX-X

23、X-XX 合作者 評(píng)分 XXXX 氨基酸的薄層層析 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 指導(dǎo)老師 第 X 實(shí)驗(yàn)室 XXX 教師簽名 批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握薄層層析法的實(shí)驗(yàn)原理。 2、掌握氨基酸薄層層析法的基本操作方法。3、掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（ Rf 值）來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液） 的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種。是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為 0.25 毫米左右） 后，在此薄層上進(jìn)行層析分離的分析方法。 一般是將固體吸附劑涂布在 平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開(kāi)溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑 對(duì)不同

24、氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開(kāi)溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄 板上的混合氨基酸樣品隨著展開(kāi)劑的移動(dòng)速率也不同， 因而可以彼此分開(kāi)。 （即通過(guò) 吸附-解吸-再吸附 -再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開(kāi)來(lái)）硅膠吸附薄層層析：吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠。硅膠：表達(dá)式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)， 它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基 （ Si OH）， 這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附 .硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)： 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。 硅醇基顯較弱的酸性，因此，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分

25、離，堿性 成分不能用它分離。 硅膠的活化溫度通常為 105 110 ，不能過(guò)高。2、氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮、氨及 醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯 色。Rf 值(rate of3、混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對(duì)遷移率 flow )層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為 Rf 值。即：Rf= 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離 原點(diǎn)到斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)前沿的距離 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的， 故移動(dòng)速率 （ Rf 值）也是恒定的， 因此可以根據(jù) Rf 值來(lái)鑒定被分

26、離的物質(zhì)。三、材料與方法：（一）、材料：分析樣品（氨基酸混合液） 、吸附劑（硅膠） 、粘合劑（ 0.5%的羧 甲基纖維素鈉） 、氨基酸的異丙醇溶液 （丙氨酸、 精氨酸、甘氨酸）、展開(kāi)-顯色劑（正 丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液） ；（二）、器材：層析板（5cm× 15cm）、尺子、鉛筆、小燒杯、 玻棒、量筒（ 10ml）、 吹風(fēng)機(jī)、毛細(xì)玻璃管、層析缸、藥匙、烘箱；（三）、方法：1、實(shí)驗(yàn)流程：2、操作步驟：（ 1）薄層板的制備：（ 2）點(diǎn)樣：（ 3）層析：4）顯色：四、結(jié)果與討論：（一）結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：篇三：柱 層 析、薄 層 層 析柱色譜、薄層色譜一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解色譜法分離提純有

27、機(jī)化合物的基本原理和應(yīng)用。2、掌握柱層析、薄層層析的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理色譜法（ Chromatography ）亦稱色層法、層析法等。色譜法是分離、純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。色譜法的基本原理是 利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親和性的 差異，使混合物的溶液流經(jīng)該種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用，從而使各組分分 離。色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用主要包括以下幾方面 :1、分離混合物 一些結(jié)構(gòu)類似、 理化性質(zhì)也相似的化合物組成的混合物， 一般 應(yīng)用化學(xué)方法分離很困難，但應(yīng)用色譜法分離，有時(shí)可得到滿意的結(jié)果。2、精制提純化合物 有機(jī)化合物中含有少量結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)

28、， 不易除去， 可利 用色譜法分離以除去雜質(zhì)，得到純品。3、鑒定化合物 在條件完全一致的情況， 純粹的化合物在薄層色譜或紙色譜中 都呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（ Rf 值），所以利用色譜法可以鑒定化合物的純 度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。但影響比移值的因素很多，如薄 層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級(jí)，外界溫度和展開(kāi)劑純度、組成、 揮發(fā)性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測(cè)定某一試樣時(shí)，最 好用已知樣品進(jìn)行對(duì)照。4、觀察一些化學(xué)反應(yīng)是否完成， 可以利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點(diǎn)的逐 步消失，以證明反應(yīng)完成與否。吸附色譜主要是以氧化鋁、硅膠等為吸附劑，將

29、一些物質(zhì)自溶液中吸附到它的 表面上，而后用溶劑洗脫或展開(kāi)，利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附作用，和 它們?cè)谌軇┲胁煌娜芙舛?，也就是利用不同化合物在吸附劑上和溶液之間分布情 況的不同而得到分離。 吸附色譜分離可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式。 柱色譜常 用的有吸附色譜和分配色譜兩種。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠為吸附劑。分配色譜 以硅膠、硅藻土和纖維素為支持劑，以吸收較大量的液體作為固定相。柱色譜常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭等。供色譜使 用的氧化鋁有酸性、中性和堿性三種。堿性氧化鋁適用于碳?xì)浠衔?、生物堿以及 其它堿性化合物的分離。中性氧化鋁應(yīng)用最廣，適用于醛、酮、醌以及酯類

30、化合物 的分離。酸性氧化鋁適用于有機(jī)酸類的分離。氧化鋁的活化分 IV 五級(jí)， I 級(jí)的 吸附作用太強(qiáng)， V 級(jí)的吸附作用太弱。所以一般常采用 II ， III 級(jí)?；衔锏奈叫院退鼈兊臉O性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團(tuán)其吸 附性較強(qiáng)。氧化鋁對(duì)各種化合物的吸附性按下列順序遞減。酸、堿 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 鹵代 物、醚 > 烯 > 飽和烴。試樣吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進(jìn)行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑。常 用洗脫溶劑的極性按以下次序遞增 :己烷、石油醚環(huán)已烷四氯化碳三

31、氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲 烷三氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì) 的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 屬固- 液吸附色譜， 它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)， 一 方面適用于少量樣品 （幾微克， 甚至 0.01 微克）的分離； 另一方面在制作薄層板時(shí)， 把吸附層加厚加大，又可用來(lái)精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易 發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng) 及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試” 。薄層色譜分為薄層吸附色譜與薄層分配色譜兩種， 本節(jié)介紹的是薄層吸附色譜。 薄層色譜是將吸附劑均勻地

32、涂在玻璃板 （或某些高分子薄膜 ）上作為固定相， 經(jīng)干燥、 活化后點(diǎn)上待分離的樣品用適當(dāng)極性的有機(jī)溶劑作為展開(kāi)劑 （即流動(dòng)相）。當(dāng)展開(kāi)劑 在吸附劑上展開(kāi)時(shí)，由于樣品中各組分對(duì)吸附劑吸附能力不同，發(fā)生了無(wú)數(shù)次吸附 和解吸過(guò)程，吸附能力弱的部分（即極性較弱的）隨流動(dòng)相迅速向前移動(dòng)，吸附能 力強(qiáng)的組分（即極性較強(qiáng)的）移動(dòng)慢。利用各組分在展開(kāi)劑中溶解能力和被吸附能力的不同，最終將各組分彼此分 開(kāi)。如果各組分本身有顏色則薄層板干燥后會(huì)出現(xiàn)一系列高低不同的斑點(diǎn)，如果本身無(wú) 色，則可用各種顯色方法使之顯色，以確定斑點(diǎn)位置。在薄板上混合物的每個(gè)組分 上升的高度與展開(kāi)劑上升的前沿之比稱為該化合物的 f 值，又稱

33、比移值。對(duì)于一 個(gè)化合物當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)其 f 值是一樣的。薄層色譜最常用的吸附劑是硅膠及氧化鋁。硅膠是無(wú)定形多孔物質(zhì)。略具酸性，適用于中性或者酸性物質(zhì)的分離，薄層色 譜用的硅膠可分為： 硅膠 H- 不含粘合劑和其他添加劑。硅膠 G- 含煅燒石膏（ CaSO4·1/2H2O）、粘合劑。硅膠 HF254- 含熒光物質(zhì)，可在波長(zhǎng) 254nm紫外光下觀察熒光。硅膠 GF254- 含煅燒石膏及熒光物質(zhì)。與硅膠相似氧化鋁也因含粘合劑或熒光劑而分為氧化鋁G及 GF254及氧化鋁HF254。氧化鋁的極性比硅膠大，比較適用分離極性小的化合物。通常將薄板按加粘合劑和不加粘合劑分為兩種，加粘合劑的薄層稱

34、硬板，不加 粘合劑的稱軟板。常用的粘合劑除煅燒石膏外還有淀粉、羧甲基纖維素鈉（CMC）化合物的吸附能力與它們的極性成正比，極性大則與吸附劑的作用強(qiáng)，隨展開(kāi) 劑移動(dòng)慢， Rf 值??；反之極性小則 Rf 值大，因此利用硅膠或氧化鋁薄層色譜可把 不同極性的化合物分離，甚至結(jié)構(gòu)相近的順、反異構(gòu)體也可分開(kāi)。三、基本操作： （含儀器裝置和主要流程圖）1、柱色譜操作步驟：（ 1）（2） （3）薄層板在不同的層析缸中展開(kāi)的方式柱色譜裝置（ 1 ）裝柱：取清潔、干燥色譜柱，在玻璃管底鋪一層玻璃棉或脫脂棉，輕輕 塞緊，再在玻璃棉上蓋一層厚約 0.5cm 的石英砂（或用一張比柱直徑略小的濾紙代 替），而后將氧化鋁裝

35、入管內(nèi)（濕法或干法） 。濕法裝柱：是將備用的溶劑裝入管內(nèi)，約為柱高的四分之三，而后將氧化鋁和 溶劑調(diào)成糊狀，慢慢地倒入管中。此時(shí)應(yīng)將管的下端旋塞打開(kāi)。干法裝柱：是在管的上端放一干燥漏斗，使氧化鋁均勻地經(jīng)干燥漏斗成一細(xì)流 慢慢裝入管中，中間不應(yīng)間斷，時(shí)時(shí)輕輕敲打柱身，使裝填均勻，全部加入后，再 加入溶劑，使氧化鋁全部潤(rùn)濕。另外也可先將溶劑加入管內(nèi)，約為柱高的四分之三 處，而后將氧化鋁通過(guò)一粗頸玻璃漏斗慢慢倒入并輕輕敲擊柱身。此法較簡(jiǎn)便。2）加樣： 把要分離的試樣配制成適當(dāng)濃度的溶液。 將氧化鋁上多余的溶劑放 出，直到柱內(nèi)液體表面到達(dá)氧化鋁表面時(shí)，停止放出溶劑。沿管壁加入試樣溶液， 注意不要使溶液

36、把氧化鋁沖松浮起，試樣溶液加完后，開(kāi)啟下端旋塞，使液體漸漸 放出，至溶劑液面和氧化鋁表面相齊（勿使氧化鋁表面干燥）即可用溶劑洗脫。（ 3）洗脫和分離：在洗脫和分離的過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)注意： 不斷加入洗脫劑， 并保持一定高度的液面， 在整個(gè)操作中勿使氧化鋁表面的 溶液流干，一旦流干，再加溶劑，易使氧化鋁柱產(chǎn)生氣泡和裂縫，影響分離效果。 收集洗脫液，如試樣各組分有顏色，在氧化鋁柱上可直接觀察。洗脫后分別 收集各個(gè)組分。在多數(shù)情況下，化合物沒(méi)有顏色，收集洗脫液時(shí)，多采用等份收集， 每份洗脫劑的體積隨所用氧化鋁的量及試樣的分離情況而定。 控制洗脫液的流出速度，一般不宜太快，太快了柱中交換來(lái)不及達(dá)到平衡， 因

37、而影響分離效果。 由于氧化鋁表面活性較大， 有時(shí)可能促使某些成分破壞， 所 以應(yīng)盡量在一定時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱色譜的分離，以免試樣在柱上停留的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 發(fā)生變化。2、薄層色譜操作步驟：（1）點(diǎn)樣 在距薄板一端 1cm處用鉛筆輕輕劃一橫線作為起始線。 將樣品溶于低 沸點(diǎn)溶劑（如甲醇、乙醇、丙醇、氯仿、苯、乙醚及四氯化碳）配成1%左右的溶液，用內(nèi)徑 1mm管口平齊的毛細(xì)管點(diǎn)樣，垂直輕輕的點(diǎn)在起點(diǎn)線上。若溶液太稀。一次 點(diǎn)樣不夠， 則可待前一次試樣點(diǎn)干后， 在原點(diǎn)樣處再點(diǎn)， 點(diǎn)樣后的直徑不要超過(guò) 2mm， 點(diǎn)樣斑點(diǎn)過(guò)大，往往會(huì)造成脫尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，影響分離效果。一塊薄層板可以點(diǎn) 多個(gè)樣，但點(diǎn)樣點(diǎn)之間距

38、離以 0.5 1.5cm 為宜。（2）展開(kāi)劑的選擇和展開(kāi) 展開(kāi)劑的選擇主要是根據(jù)樣品的極性、 溶解度和吸附 劑的活性等因素。溶液的極性越大，則對(duì)化合物解吸的能力越強(qiáng)，也就是說(shuō) f 值 也越大。如果出現(xiàn)樣品各組分 f 值都較小，則可加入適量極性較大的溶劑。薄層色譜的展開(kāi)需要在密閉容器內(nèi)進(jìn)行。將選擇的展開(kāi)劑倒入層析槽或?qū)游龈字校ㄒ簩痈叨燃s為 0.5cm），待容器內(nèi)容積蒸汽達(dá)到飽和后，再將點(diǎn)好的薄層板放入 槽或缸中進(jìn)行展開(kāi)（含粘合劑的板可傾斜 45° 60°角），注意點(diǎn)樣的位置必須要在 展開(kāi)劑液面之上。當(dāng)展開(kāi)劑展開(kāi)，其前沿上升到板頂端5 10mm處時(shí)，取出薄板，用鉛筆劃處前沿的位置、晾干。（3）顯色 晾干后若分離的化合物本身有色， 在薄層板上可看到分開(kāi)的各組分斑 點(diǎn)。如果本身無(wú)色，用的是含熒光劑的薄層板在紫外光下一般呈暗色斑點(diǎn)；有時(shí)用 腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等顯色；也可待溶劑揮發(fā)后的薄板放入 有幾粒碘并充滿碘蒸汽的密閉容器中許多化合物都能與碘形成黃色斑點(diǎn)，但要注意 當(dāng)?shù)庹羝麚]發(fā)后斑點(diǎn)易消失。除此之外，也可以在薄層板上溶劑蒸發(fā)前噴霧顯色。用各種顯色方法使斑點(diǎn)出現(xiàn)后，應(yīng)立即用鉛筆劃出斑點(diǎn)的位置，并計(jì)算 f 值四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1 、柱層析（1）試劑熒光黃和堿性湖藍(lán) BB 的分離分離樣品： 0.5 毫升溶有 0.5 毫克熒光黃和 0.5 毫克堿性湖藍(lán)