酶的非水相催化人們以往普遍認為只有在水溶液中酶才具有

1、第六章 酶的非水相催化人們以往普遍認為只有在水溶液中酶才具有催化活性。酶在非水相介質中催化反應的研究：在理論上進行了非水介質(包括有機溶劑介質，超 臨界流體介質，氣相介質，離子液介質等)中酶的結構與功能、非水介質中酶的作用機制， 非 水介質 中酶催 化作用動 力學等 方面的 研究，初 步建立 起非水 酶學( non-aqueous enzymology )的理論體系。非水介質中酶催化作用的應用研究，取得顯著成果。1. 酶非水相催化的研究概況 酶在非水介質中進行的催化作用稱為酶的非水相催化。1.1 有機介質中的酶催化：有機介質中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。適用于底物、

2、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。 酶在有機介質中由于能夠基本保持其完整的結構和活性中心的空間構象，所以能夠發(fā) 揮其催化功能。酶在有機介質中起催化作用時，酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇 性和熱穩(wěn)定性等都有所改變。1.2 氣相介質中的酶催化：氣相介質中的酶催化是指酶在氣相介質中進行的催化反應。 適用于底物是氣體或者能夠轉化為氣體的物質的酶催化反應。由于氣體介質的密度低，擴散容易，所以酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化 作用有明顯的不同特點。1.3 超臨界流體介質中的酶催化：超臨界介質中的酶催化是指酶在超臨界流體中進行的催化反應。用于酶催化反應的超臨界流體應當對酶的結

3、構沒有破壞作用，對催化作用沒有明顯的不良影響； 具有良好的化學穩(wěn)定性， 對設備沒有腐蝕性； 超臨界溫度不能太高或太低， 最好 在室溫附近或在酶催化的最適溫度附近； 超臨界壓力不能太高， 可節(jié)約壓縮動力費用； 超臨 界流體要容易獲得，價格要便宜等。1.4 離子液介質中的酶催化： 離子液介質中的酶催化是指酶在離子液中進行的催化作用。離子液( ionic liquids )是由有機陽離子與有機(無機)陰離子構成的在室溫條件下呈 液態(tài)的低熔點鹽類， 揮發(fā)性低、 穩(wěn)定性好。 酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū) 域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。在酶的非水相催化中，研究最多的非水介質是有機

4、溶劑。酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等水解酶，過氧化氫酶、過氧化物酶、醇脫氫 酶、膽固醇氧化酶、 多酚氧化酶、 細胞色素氧化酶等氧化還原酶以及醛縮酶等轉移酶中的十 幾種酶都可以在適當?shù)挠袡C溶劑介質中起催化作用。 而且酶在有機介質中的熱穩(wěn)定性比水溶 液中顯著提高。在理論上進行了非水介質(包括有機溶劑介質，超臨界流體介質，氣相介質，離子液介質 等)中酶的結構與功能、 非水介質中酶的作用機制， 非水介質中酶催化作用動力學等方面的 研究，初步建立起非水酶學( non-aqueous enzymology )的理論體系。并進行了非水介質中，特別是在有機介質中酶催化作用的應用研究，利用酶在有機介質

5、中 的催化作用進行多肽、酯類等的生產(chǎn)，甾體轉化， 功能高分子的合成， 手性藥物的拆分等方 面均取得顯著成果。2. 有機介質中水和有機溶劑對酶催化反應的影響2.1 有機介質反應體系：常見的有機介質反應體系包括：(1) 微水介質( microaqueous media )體系 :微水介質體系是由有機溶劑和微量的水組成的反應體系，是在有機介質酶催化中廣泛 應用的一種反應體系。微量的水主要是酶分子的結合水，它對維持酶分子的空間構象和催化活性至關重要。 另外有一部分水分配在有機溶劑中。通常所說的有機介質反應體系主要是指微水介質體系。(2) 與水溶性有機溶劑組成的均一體系：這種均一體系是由水和極性較大的有

6、機溶劑互相混溶組成的反應體系。酶和底物都是以溶解狀態(tài)存在于均一體系中。 由于極性大的有機溶劑對一般酶的催化 活性影響較大，所以能在該反應體系的進行催化反應的酶較少。(3) 與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系：這種體系是由水和疏水性較強的有機溶劑組成的兩相或多相反應體系。 游離酶、 親水 性底物或產(chǎn)物溶解于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶解于有機溶劑相。如果采用固定化酶，則以懸浮形式存在兩相的界面。催化反應通常在兩相的界面進行。 一般適用于底物和產(chǎn)物兩者或其中一種是屬于疏水 化合物的催化反應。(4) (正)膠束體系：膠束又稱為正膠束或正膠團，是在大量水溶液中含有少量與水不相混溶的有機溶劑， 加入表面

7、活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，有機溶劑包在液滴內(nèi)部。反應時，酶在膠束外面的水溶液中，疏水性的底物或產(chǎn)物在膠束內(nèi)部。反應在膠束的兩相界面中進行。(5) 反膠束體系：反膠束又稱為反膠團，是指在大量與水不相混溶的有機溶劑中，含有少量的水溶液， 加入表面活性劑后形成的油包水的微小液滴。表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，水溶液包在膠束內(nèi)部。反應時，酶分子在反膠束內(nèi)部的水溶液中，疏水性底物或產(chǎn)物在反膠束外部，催化反 應在兩相的界面中進行。2.2 水對有機介質中酶催化的影響：(1) 水對酶分子空間構象的影響：酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構象。維持酶分子

8、完整的空間構象所必需的最低水量稱為必需水( essential water )。必需水與酶分子的結構和性質有密切關系。 不同的酶， 所要求的必需水的量差別很大。(2) 水對酶催化反應速度的影響：有機介質中水的含量對酶催化反應速度有顯著影響。在催化反應速度達到最大時的水含量稱為最適水含量。在實際應用時應當根據(jù)實際情況，通過實驗確定最適水含量。(3) 水活度：在有機介質中含有的水，主要有兩類，一類是與酶分子緊密結合的結合水，另一類是 溶解在有機溶劑中的游離水。研究表明，在有機介質體系中，酶的催化活性隨著結合水量的增加而提高。水活度( water activity, Aw )是指體系中水的逸度( f

9、ugacity )與純水逸度之比。通?？梢杂皿w系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。即：Aw = P/P 0式中， P 為在一定條件下體系中水的蒸汽壓，Po 為在相同條件下純水的蒸汽壓 研究表明，在一般情況下，最適水含量隨著溶劑極性的增加而增加。而最佳水活度與溶劑的極性大小沒有關系。所以采用水活度作為參數(shù)來研究有機介 質中水對酶催化作用的影響更為確切。2.3 有機溶劑對有機介質中酶催化的影響： 常用的有機溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷 等。(1) 有機溶劑對酶結構與功能的影響：酶具有完整的空間結構和活性中心才能發(fā)揮其催化功能。在有機溶劑中，酶分子(經(jīng)

10、過修飾后可溶于有機溶劑者除外)不能直接溶解，而是懸 浮在溶劑中進行催化反應。有些酶在有機溶劑的作用下，其空間結構會受到某些破壞，從而使酶的催化活性受到 影響甚至引起酶的變性失活。(2) 有機溶劑對酶分子表面結構的影響：酶在有機介質中與有機容劑接觸，酶分子的表面結構將有所變化。(3) 有機溶劑對酶活性中心結合位點的影響：當酶懸浮于有機溶劑中，有一部分溶劑能滲入到酶分子的活性中心，與底物競爭活性 中心的結合位點，降低底物結合能力，從而影響酶的催化活性。有機溶劑分子進入酶的活性中心，會降低活性中心的極性，可能降低酶與底物的結合 能力。(4) 有機溶劑對酶活性的影響：有些有機溶劑，特別是極性較強的有機

11、溶劑，如甲醇，乙醇等，會奪取酶分子的結合 水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。有機溶劑極性的強弱可以用極性系數(shù) igP表示。P是指溶劑在正辛烷與水兩相中的分 配系數(shù)。極性系數(shù)越大，表明其極性越??；反之極性系數(shù)越小，則極性越強。研究表明， 有機溶劑的極性越強， 越容易奪取酶分子結合水， 對酶活力的影響就越大。 極性系數(shù) ig P< 2 的極性溶劑一般不適宜作為有機介質酶催化的溶劑使用。(5) 有機溶劑對底物和產(chǎn)物分配的影響： 有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產(chǎn)物的分配，從而影響酶 的催化反應。有機容劑能改變酶分子必需水層中底物和產(chǎn)物

12、的濃度。一般選用2 <lg P令 的有機溶劑作為有機介質為宜。3. 酶在有機介質中的催化特性3.1 底物專一性：在有機介質中， 由于酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態(tài)發(fā)生某些變化， 致使酶的底物特異性會發(fā)生改變。不同的有機溶劑具有不同的極性，所以在不同的有機介質中，酶的底物專一性也不一樣。在極性較強的有機溶劑中， 疏水性較強的底物容易反應； 而在極性較弱的有機溶劑中， 疏水性較弱的底物容易反應 。3.2 對映體選擇性：酶的對映體選擇性(enantioselectivity )又稱為立體選擇性或立體異構專一性，是酶在對 稱的外消旋化合物中識別一種異構體的能力大小的指標。酶立體選擇

13、性的強弱可以用立體選擇系數(shù)(Kld )的大小來衡量。立體選擇系數(shù)越大，表明酶催化的對映體選擇性越強。立體選擇系數(shù)與酶對L-型和D-型兩種異構體的酶轉換數(shù)(Kcat)和米氏常數(shù)(Km)有關。 即：(Kcat /K n) LK LD =(Kcat/Kn)D式中，Kld :立體選擇系數(shù)L:L-型異構體D:D-型異構體Km：米氏常數(shù)。即酶催化反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度。Kcat：酶的轉換數(shù)。是酶催化效率的一個指標。指每個酶分子每分鐘催化底物轉化 的分子數(shù)。酶在有機介質中催化，與在水溶液中催化比較，由于介質的特性發(fā)生改變，而引起酶的對映體選擇性也發(fā)生改變。酶在水溶液中催化的立體選擇性較強，

14、而在疏水性強的有機介質中，酶的立體選擇性較差。3.3區(qū)域選擇性：酶在有機介質中進行催化時，具有區(qū)域選擇性(regioselectivity ),即酶能夠選擇底物分子中某一區(qū)域的基團優(yōu)先進行反應。酶區(qū)域選擇性的強弱可以用區(qū)域選擇系數(shù)Krs的大小來衡量。區(qū)域選擇系數(shù)與立體選擇系數(shù)相似，只是以底物分子的區(qū)域位置1 , 2，代替異構體的構型 L,D。即：Ki , 2 =(Kcat/Km)1 /(Kcat/Km)23.4鍵選擇性：酶在有機介質中進行催化的另一個顯著特點是具有化學鍵選擇性。鍵選擇性與酶的來源和有機介質的種類有關。3.5熱穩(wěn)定性：許多酶在有機介質中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中的熱穩(wěn)定性更好。酶在有

15、機介質中的熱穩(wěn)定性還與介質中的水含量有關。通常情況下，隨著介質中水含 量的增加，其熱穩(wěn)定性降低。在有機介質中，酶的熱穩(wěn)定性之所以增強，可能是由于有機介質中缺少引起酶分子變性 失活的水分子所致。某些酶在有機介質與水溶液中的熱穩(wěn)定性如表7-1所示。表7-1某些酶在有機介質與水溶液中的熱穩(wěn)定性酶介質條件熱穩(wěn)定性豬胰脂肪酶三丁酸甘油酯T1/2 < 26 h水，pH7.0T1/2 < 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇T1/2 =1.5 h水，pH7.0T1/2 < 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90 C, 400 h活力剩余40 %胰凝乳蛋白酶正辛烷，100 CT1/2 = 80

16、min水，pH 8.0, 55 CT1/2 = 15 min枯草桿菌蛋白酶正辛烷，110 CT1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110 C, 6 h活力剩余95 %水，pH 8.0, 90 CT1/2 < 10 min酸性磷酸酶正十六烷，80 CT1/2 = 8 min水，70 CT1/2 = 1 min腺苷三磷酸酶甲苯，70 CT1/2 > 24 h(F i -ATPase)水，60 CT1/2 < 10 min限制性核酸內(nèi)切酶正庚烷，55 C, 30d活力不降彳氐(Hi nd 川)伊匍萄糖苷酶2-丙醇，50 C, 30 h活力剩余80 %溶菌酶環(huán)己烷，110 CT1

17、/2 =140 min水T1/2 = 10 min酪氨酸酶氯仿，50 CT1/2 =90 min水，50 CT1/2 =10 min醇脫氫酶正庚烷，55 CT1/2 > 50 d細胞色素氧化酶甲苯，0.3 %水T1/2 =4.0 h甲苯，1.3 %水T1/2 =1.7 min3.6 pH值特性：在有機介質反應中，酶所處的 pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用的緩沖液pH值相同。這種現(xiàn)象稱之為pH印記(pH-imprinting )或稱為pH記憶。酶在有機介質中催化反應的最適 pH值通常與酶在水溶液中反應的最適pH值接近或者相同。利用酶的這種pH印記特性，可以通過控制緩沖液中pH值的

18、方法，達到控制有機介質中酶催化反應的最適 pH值。4. 有機介質中酶催化反應的條件及其控制酶在有機介質中可以催化多種反應，主要包括：合成反應、轉移反應、醇解反應、氨解反 應、異構反應、氧化還原反應、裂合反應等。酶在有機介質中的各種催化反應受到各種因素的影響：酶的種類和濃度、底物的種類和濃 度、有機溶劑的種類，水含量、溫度、 pH 和離子強度等。4.1 有機介質中酶催化反應的類型：(1) 合成反應： 脂肪酶或酯酶在有機介質中可以催化有機酸和醇進行酯類的合成反應： 蛋白酶可以在有機介質中催化氨基酸進行合成反應，生成各種多肽。(2) 轉移反應：(3) 醇解反應：(4) 氨解反應 :(5) 異構反應：

19、(6) 氧化還原反應：(7) 裂合反應：4.2 酶的選擇 ：不同的酶具有不同的結構和特性，同一種酶，由于來源的不同和處理方法(如純度、 凍干條件、固定化載體和固定化方法、修飾方法和修飾劑等)的不同，其特性也有所差別， 所以要根據(jù)需要通過試驗進行選擇。在酶催化反應時， 通常酶所作用的底物濃度遠遠高于酶濃度， 所以酶催化反應速度隨 著酶濃度的升高而升高，兩者成正比。在有機介質中進行催化反應，對酶的選擇不但要看催化反應的速度的大小，還要特別注意酶的穩(wěn)定性、底物專一性、對映體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性等。4.3 底物的選擇和濃度控制：御于酶在有機介質中的底物專一性與在水溶液中的專一性有些差別，所以要

20、根據(jù)酶在所使用的有機介質中的專一性選擇適宜的底物。底物的濃度對酶催化反應速度有顯著影響，一般說來，在底物濃度較低的情況下，酶催化反應速度隨底物濃度的升高而增大。 當?shù)孜镞_到一定濃度以后， 再增加底物濃度， 反應 速度的增大幅度逐漸減少，最后趨于平衡，逐步接近最大反應速度。4.4 有機溶劑的選擇：有機溶劑是影響酶在有機介質中催化的關鍵因素之一，在使用過程中要根據(jù)具體情況進行選擇。有機溶劑的極性選擇要適當，極性過強（lgP < 2）的溶劑，會奪取較多的酶分子表面結合水， 影響酶分子的結構， 并使疏水性底物的溶解度降低，從而降低酶反應速度， 在一 般情況下不選用；極性過弱（igP > 5

21、）的溶劑，雖然對酶分子必需水的奪取較少，疏水性底物在有機 溶劑中的溶解度也較高，但是底物難于進入酶分子的必須水層，催化反應速度也不高。通常選用2 < igP < 5的溶劑作為催化反應介質。4.5 水含量的控制：有機介質中，水的含量對酶分子的空間構象和酶催化反應速度有顯著影響。 要通過試驗確定反應體系的最適水含量。最適水含量與溶劑的極性有關，通常隨溶劑極性的增大，最適水含量也增大；而達到 最大反應速度的水活度卻變化不大，都在0.50.6之間。在實際應用時應當控制反應體系的水活度在0.50.6的范圍內(nèi)。4.6溫度控制:溫度是影響酶催化作用的主要因素之一。在最適溫度下酶催化的反應速度達到

22、最大，這個溫度稱為。在微水有機介質中，由于水含量低，酶的熱穩(wěn)定性增強，所以其最適溫度高于在水溶液中催化的最適溫度。要注意的是酶與其它非酶催化劑一樣，溫度升高時，其立體選擇性降低。4.7 pH值的控制：酶在有機介質中催化的最適 pH值通常與在水溶液中催化的最適pH值相同或者接近。在有機介質中，酶的催化活性與酶在緩沖溶液中的pH值和離子強度有密切關系。酶分子從緩沖溶液轉到有機介質后，酶分子保留了原有的pH印記。通過調(diào)節(jié)緩沖溶液pH和離子強度的方法對有機介質中酶催化的pH值和離子強度進行調(diào)節(jié)控制。5. 酶非水相催化的應用酶在有機介質中的催化如見表7-2）。表7-2 酶非水相催化的應用酶催化反應應用脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯的選擇性聚合?；蚀嫉孽；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多