免疫組化組織細(xì)胞的取材、固定、切片操作方法及要點(diǎn)

1、 組織標(biāo)本包括動(dòng)物標(biāo)本、手術(shù)活檢標(biāo)本、尸體解剖標(biāo)本及細(xì)胞標(biāo)本等,有關(guān)各種標(biāo)本的取材方法分述如下。一、動(dòng)物的致死法及取材(一致死法(1空氣栓塞法向動(dòng)物靜脈內(nèi)注入一定量的空氣,使動(dòng)物很快死亡。一般適用大動(dòng)物,例如兔、犬、貓等動(dòng)物。(2麻醉法可將浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷的棉球連同動(dòng)物一起放人密閉容器內(nèi)進(jìn)行麻醉,也可用4%戊巴比妥作靜脈注射,或用20%氨基甲酸乙酯做腹腔注射。適用于鼠等小動(dòng)物。(3斷頭法用剪刀剪去動(dòng)物的頭部,待血液流出后立即取材。適用于小動(dòng)物。(4去頭法用重物猛擊頭后部或?qū)?dòng)物頭后部猛撞桌沿。(5股動(dòng)脈放血法動(dòng)物麻醉后,切開股動(dòng)脈放血致死。(二取材注意事項(xiàng)(1最好在動(dòng)物心臟還在跳動(dòng)時(shí)立

2、即取材,并迅速投入環(huán)保組織固定液內(nèi)。臟器的上皮組織易變質(zhì),爭(zhēng)取在死后半小時(shí)內(nèi)取材完畢,否則免疫組化染色時(shí)會(huì)產(chǎn)生背景染色。(2切取組織使用的刀、剪要求鋒利,避免來回挫動(dòng)組織。因動(dòng)物組織質(zhì)脆,因此夾取組織時(shí)切勿用力過重,以免擠壓損傷組織。二、尸體解剖的取材尸體解剖的取材應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行,一般取材部位和數(shù)量如下。(1心和大血管右心室一塊,左心室一塊,主動(dòng)脈一塊,取材部位可在距主動(dòng)脈瓣5cm處。(2肺右下葉一塊,切成正方形;左下葉一塊,可切成長(zhǎng)方形。(3肝右葉一塊,切成正方形;左葉一塊,切成長(zhǎng)方形。(3脾一塊。(4胰一塊。(6腎兩腎各一塊,包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂。右腎一塊切成正方形,左腎一塊切成長(zhǎng)(7

3、膀胱一塊。(8腎上腺左、右各取一塊。(9消化道食管一塊,胃竇部一塊,小腸一塊,淋巴結(jié)一塊,直腸一塊。(10骨脊椎骨一塊。(11胸腺一塊。(12子宮宮頸和宮體數(shù)塊。(13睪丸或卵巢各一塊。(14腦左側(cè)運(yùn)動(dòng)區(qū)一塊,左側(cè)豆?fàn)詈艘粔K,小腦一塊。(15腦下垂體一塊,前葉或包括前后葉。如有較嚴(yán)重或復(fù)雜病變時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加取材數(shù)量,以便徹底檢查而作出正確診斷。三、活檢標(biāo)本的取材(一常規(guī)活檢標(biāo)本的取材應(yīng)注意病變的部位、形狀、大小、顏色以及與周圍組織的界限,有無完整的包膜。取材時(shí)應(yīng)取病變部位、病變的切緣、病變與正常組織交界處以及遠(yuǎn)離病灶的正常組織。取材用的刀剪應(yīng)鋒利,避免擠壓組織;組織的切面應(yīng)平整,組織切忌過大、過

4、厚,否則不僅浪費(fèi)試劑,而且會(huì)造成固定、脫水不良而影響鏡下觀察。(二腎穿刺標(biāo)本的取材進(jìn)行穿刺取得組織后,立即用生理鹽水或PBS沖洗數(shù)次去除血跡,并迅速判斷所穿組織是否為腎組織(腎組織應(yīng)為暗紅色。當(dāng)確定為腎組織后,立即將組織臵于木板上,迅速測(cè)量其長(zhǎng)度;用解剖顯微鏡或放大鏡進(jìn)行觀察,以區(qū)別皮質(zhì)和髓質(zhì),并觀察標(biāo)本是否有腎小球。在解剖顯微鏡下,腎皮質(zhì)較淡,皮質(zhì)區(qū)可見一些分布不規(guī)則、朦朧的紅色小點(diǎn),此即為腎小球。使用解剖顯微鏡可幫助區(qū)別組織,作出準(zhǔn)確的判斷,使腎活檢可靠。穿刺所取得的標(biāo)本用手術(shù)刀片切開,并迅速固定,一半放人裝有光鏡固定液的青霉素小瓶?jī)?nèi),另一半放人裝有電鏡固定液的小瓶?jī)?nèi),均臵于冰瓶?jī)?nèi)保存。(

5、三小標(biāo)本的活檢取材小標(biāo)本常見為宮頸、宮內(nèi)膜、鼻咽、口腔、喉以及各種內(nèi)窺鏡所取得的組織。它們體積較小,因此取材時(shí)要用擦鏡紙包起來再進(jìn)行固定、脫水,特別是由胃鏡、腸鏡等所取的組織,取材時(shí)一定要滴上伊紅,以防止丟失。活檢組織多用活檢鉗夾取,常因過度擠壓而變形。病灶表面有出血壞死,活檢時(shí)難于采取到深部組織。因此,活檢鉗的刀口必須鋒利,活檢時(shí)必須采取主要病灶區(qū),盡量避開壞死區(qū)。免疫組化組織細(xì)胞的固定凡需進(jìn)行病理研究的標(biāo)本均需進(jìn)行固定。將組織臵于某些化學(xué)試劑中,使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用盡量接近于其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位臵稱為固定。而用于免疫組化研究標(biāo)本的固定不僅是使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固,終

6、止或減少外源性和內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng),防止組織細(xì)胞自溶,更重要的是保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性,使抗原不失活,不發(fā)生彌散。不同的抗原,其抗原穩(wěn)定性不同,依抗原耐受固定液的程度可分為:不穩(wěn)定性抗原,如T淋巴細(xì)胞表面抗原屬此類抗原,一般以冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色;半穩(wěn)定性抗原,如B淋巴細(xì)胞的胞漿免疫球蛋白等;較穩(wěn)定抗原,例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S100、Keratin和部分多肽類激素等,其抗原性受固定劑種類、固定時(shí)間、溫度等影響不大。固定劑的種類很多,性能不一,因此固定不同的組織應(yīng)選擇合適的固定劑,特別是標(biāo)記半穩(wěn)定抗原時(shí),更要選擇合適的固定劑和固定條件。一、固定液的種類較好的固

7、定液應(yīng)具有強(qiáng)滲透力,能迅速滲入至組織內(nèi)部;其次不會(huì)使組織發(fā)生過度收縮變形,并能使組織內(nèi)易觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì);還要使組織達(dá)到一定硬度,有較好的折光率。固定液分為簡(jiǎn)單固定液和混合固定液。因目前大多數(shù)固定液都是有毒有機(jī)溶劑組成,歐美國家已不再使用,基本由環(huán)保組織固定液替代。西奈山環(huán)保組織固定液由植物多糖、乙醇、醋組成,固定效果明顯優(yōu)于常規(guī)甲醛。二、固定的方法1.浸泡法這是最常用的固定法,將取好的組織直接浸泡在固定液中,固定的時(shí)間一般在224h它適用于動(dòng)物標(biāo)本、尸檢標(biāo)本及臨床活檢標(biāo)本等。2.蒸氣法比較小而薄的標(biāo)本可用鋨酸或甲醛蒸氣固定。主要用于血液、細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織的固定。具體方法

8、:在一有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)滴人1%一2%鋨酸水溶液3滴,將涂片放人其中,固定30s至lmin左右,立即水洗后進(jìn)行染色。3.注射、灌注固定法主要適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的固定。將固定液注入血管,以達(dá)到充分的固定。經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織或全身(1局部灌注固定固定肺組織可將固定液從氣管或支氣管注入,注入速度不要太快,用力均勻,注入量適當(dāng),以免脹破肺泡。固定眼球組織可從眼后房注人固定液。固定肝、腎組織則可從肝、腎動(dòng)脈注入固定液,同時(shí)切斷其靜脈使得血液排出。腦組織的固定,必須先麻醉動(dòng)物,分離頸動(dòng)脈,注射器的針尖向著頭部的方向注入固定液。(2全身灌注固定較大的動(dòng)物往往采取輸液方法,將固定液從一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈輸入,將

9、另一側(cè)相應(yīng)的靜脈切開放血。固定液的輸入量因動(dòng)物而異,兔、貓約5001000ml,猴、狗約10002000ml。4.微波固定法近幾年來微波固定法一直可見報(bào)道。經(jīng)微波固定的組織具有收縮較小、核膜清晰、染色質(zhì)均勻、分辨清晰等特點(diǎn),但必須嚴(yán)格控制微波固定的時(shí)間和溫度。免疫組化組織細(xì)胞的脫水(一概述組織經(jīng)固定和水洗后,會(huì)有大量的水分留在組織中,而水又不能與苯融合,因此必須在透明前脫去組織中的水分。用某些溶劑將組織中的水分臵換出來的過程稱為脫水。對(duì)于不同的組織應(yīng)分開脫水,特別是一些易脆的組織(如肝、脾等應(yīng)嚴(yán)格掌握脫水時(shí)間,防止在無水酒精中停留時(shí)間過長(zhǎng)。對(duì)于動(dòng)物組織,應(yīng)比人體標(biāo)本相應(yīng)縮短脫水時(shí)間。脫水應(yīng)按照

10、從低濃度到高濃度的過程,否則標(biāo)本直接進(jìn)入高濃度溶液中極易引起組織的強(qiáng)烈收縮或使組織發(fā)生變形,從而影響切片,還會(huì)造成免疫組化實(shí)驗(yàn)過程中的脫片。(二脫水劑的種類(1乙醇最常用的脫水劑,脫水能力強(qiáng),并能使組織硬化,與二甲苯能混合。其缺點(diǎn)是在高濃度乙醇,特別是無水乙醇中停留時(shí)間長(zhǎng)會(huì)引起組織收縮、變脆而影響后續(xù)的切片。尤其是應(yīng)用全自動(dòng)脫水機(jī),因是加壓抽真空并加溫脫水,在高濃度乙醇中停留時(shí)間更不能太長(zhǎng),應(yīng)經(jīng)試驗(yàn)摸索出適合自己?jiǎn)挝幻撍枰臅r(shí)間,不能盲目從書本上套用脫水時(shí)間。脫水時(shí),應(yīng)從低濃度向高濃度梯度進(jìn)行。一般是人體組織從?5%乙醇開始,對(duì)于小動(dòng)物、胚胎及柔軟的組織可從30%乙醇開始脫水。只有脫水充分,

11、才能在透明劑中透明。若是人工脫水,必須在加蓋的容器內(nèi)進(jìn)行,尤其是高濃度乙醇很易吸收空氣中的水分,陰雨天更應(yīng)注意。在透明前最好將組織取出,用濾紙吸干后再透明。(2丙酮脫水作用比乙醇強(qiáng),但對(duì)組織的收縮也大,毒性強(qiáng),價(jià)格高,因此一般不用于常規(guī)組織的脫水,主要用于快速脫水及固定兼脫水。此時(shí)應(yīng)注意個(gè)人防護(hù),最好在帶有抽風(fēng)功能的裝臵中進(jìn)行,脫水時(shí)間13h左右。丙酮還可作為染色后的脫水劑,用于甲基綠派洛寧顯示DNA及RNA。(3正丁醇為五色液體,微溶于水,在100ml水中只能溶解8.3g,故脫水能力較弱,但能與水、乙醇及石蠟混合,因此經(jīng)正丁醇脫水的組織可直接浸蠟。它的優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織的收縮及變脆。一般用法

12、為:組織經(jīng)固定及沖洗后,依次人50%、70%、80%乙醇中脫水,然后人正丁醇,1224h后浸蠟。使用時(shí)也應(yīng)注意防護(hù)。(4叔丁醇異丁醇的一種,可與水、乙醇、二甲苯混合,可以單用或與乙醇混合使用,是一種使用較廣的脫水劑,它不會(huì)使組織收縮或變硬,不必經(jīng)過透明而直接浸蠟。電鏡上為常用的中間脫水劑。(5環(huán)己酮沸點(diǎn)為140C,冰點(diǎn)為一40C,密度與水相似,無毒,可與苯、二甲苯、氯仿等有機(jī)溶劑混合,也是石蠟溶劑,可代替純乙醇脫水后直接浸蠟,組織不會(huì)變硬,不需經(jīng)二甲苯透明。(6松脂醇組織固定后按常規(guī)經(jīng)各濃度乙醇至95%乙醇中,按下列順序進(jìn)行脫水和透明處理:浸入等份95%乙醇和松脂醇的混合液中,待組織塊下沉后轉(zhuǎn)

13、入下步處理;95%乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h;95%乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h;松脂醇I、中各浸泡1h;松脂醇5份加石蠟1份的混合液中浸泡lh,然后浸蠟包埋。多用于經(jīng)乙醇或Carnoy液固定的組織。經(jīng)松脂醇處理的組織收縮較小,發(fā)生硬化也少。中性緩沖福爾馬林影響HE染色用中性緩沖福爾馬林后,細(xì)胞核顏色的確不夠鮮艷,可在染蘇木素前用3%冰醋酸媒染10分鐘,會(huì)有所改善。免疫組化組織細(xì)胞的固定(續(xù)三、固定的注意事項(xiàng)1.固定液的量固定組織時(shí),必須有足夠的固定液,一般為組織塊體積的1015倍。固定用的容器必須足夠大,組織材料不要太多,避免組織中的水分滲出而影響固定液的濃度。2.固定

14、的組織必須新鮮組織取材后應(yīng)立即固定,否則,組織易收縮變形,并發(fā)生自溶現(xiàn)象。3.組織塊的體積4.組織固定后的沖洗組織固定后,因固定液滲到組織中,所以必須徹底沖洗,除去固定液,否則會(huì)影響下一步的脫水。特別對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間固定的標(biāo)本應(yīng)用流水沖洗,盡可能減少色素沉著。對(duì)于混合固定液固定的組織,更要及時(shí)沖洗,否則將影響免疫組化切片的質(zhì)量。四、影響固定的因素1.溫度一般固定液固定效果隨溫度升高而加強(qiáng),溫度一般在-7037之間,?以室溫22常用。某些酶的固定要求在37以下進(jìn)行,而某些病毒的固定則要在低溫下進(jìn)行,如用丙酮在-20一-40之間固定30min最佳。對(duì)于臨床活檢標(biāo)本,固定時(shí)間要求短,實(shí)踐發(fā)現(xiàn)用中性甲醛在4

15、0左右固定23h即可。2.濃度10%中性甲醛、4%多聚甲醛最合適,乙醇最常用濃度為95延。在37或室溫固定,適合于許多蛋白質(zhì)、抗原,并能保持其與抗體的反應(yīng)能力。70%的乙醇固定能力最強(qiáng)。3.固定時(shí)間固定時(shí)間要視組織塊的大小及固定液的種類、濃度、溫度而定。組織塊越大,固定時(shí)間越長(zhǎng);反之,組織塊越小,固定時(shí)間越短。固定液的穿透力與濃度成正比,固定的時(shí)間與溫度成反比?？傊?固定的時(shí)間應(yīng)根據(jù)條件而定。沒有任何一種固定液適合于所有組織的固定,應(yīng)根據(jù)條件選擇合適的固定液,可以用多種固定液固定作對(duì)比,找到比較切合本單位實(shí)際的固定液。免疫組化組織細(xì)胞的透明(一組織透明的目的及注意事項(xiàng)組織經(jīng)某些化學(xué)試劑作用后,

16、呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)稱為透明。組織透明的目的是便于浸蠟包埋,因?yàn)楹芏嗝撍畡┎荒芘c石蠟混合,必須通過透明劑的作用才能使石蠟浸入組織中,因此透明劑必須既能與脫水劑混合,又能與石蠟混合。如果組織透明不徹底,就會(huì)導(dǎo)致浸蠟不良。組織透明不徹底的原因主要是固定、脫水不良以及透明劑的純度不夠造成的。透明劑的體積應(yīng)為組織體積的5l0倍,并注意定期更換。應(yīng)用全自動(dòng)脫水機(jī)、標(biāo)本量又較大的單位,應(yīng)爭(zhēng)取每星期更換一次透明劑;標(biāo)本量小、用人工脫水的單位,在脫水結(jié)束后,可以將組織塊取出,用濾紙吸除組織中多余的脫水劑,再放人透明劑中,并觀察組織是否透明而決定是否應(yīng)更換透明劑。(二常用透明劑的種類(1因透明劑大多有強(qiáng)毒性和

17、刺激,歐美主要國家目前都已改用環(huán)保透明劑,逐步禁止使用二甲苯類有毒透明劑。西奈山環(huán)保組織透明劑系水果油調(diào)配而成,純天然,無毒有水果香味,透明效果好,正逐漸在各大醫(yī)院推廣使用。(2二甲苯為最常用的透明劑,毒性刺激性大、易揮發(fā),不溶于水,透明力強(qiáng),易使組織收縮、質(zhì)脆,故組織在二甲苯中停留時(shí)間不能太長(zhǎng),特別是動(dòng)物組織更應(yīng)嚴(yán)格掌握透明時(shí)間。二甲苯在用于染色后的透明時(shí),組織應(yīng)先浸于二甲苯和苯酚混合液(3:1后,再進(jìn)入二甲苯透明。(3甲苯和苯性質(zhì)與二甲苯相似,但透明速度較慢,對(duì)組織的收縮程度小。(4氯仿毒性大、不易使組織變脆,其透明能力較二甲苯差,因此透明時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),易揮發(fā),多用于大塊組織的透明。(5香

18、柏油劇毒、是一種柏樹樹脂,能溶于乙醇,是乙醇脫水后的良好透明劑,但透明時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24h。(6苯甲酸甲酯有毒難溶于水,溶于醚,折光率1.517。經(jīng)95%乙醇脫水后的組織可直接進(jìn)入苯甲酸甲酯透明。也可用于火棉膠切片。(7苯胺油有毒、又稱安尼林油。微溶于水,能與醇、醚、苯以及其他多種有機(jī)溶劑混合,應(yīng)注意避光保存。免疫組化組織細(xì)胞的包埋(一石蠟包埋法石蠟是組織切片技術(shù)中應(yīng)用較廣泛的包埋劑,切片石蠟須是經(jīng)多次過濾后呈半透明狀的優(yōu)質(zhì)石蠟,熔點(diǎn)為5658C的蠟較適宜。包埋時(shí)應(yīng)注意包埋面必須平整,破碎組織應(yīng)聚集在一起包埋,并注意一些特殊的包埋面。包埋蠟的溫度應(yīng)與組織塊溫度接近,過高會(huì)燙傷組織,過低使組織和石蠟分

19、離,不利于切片。(二體液包埋法體液標(biāo)本,如痰液、胃液、尿液、胸腹水等,也可行石蠟包埋。痰液應(yīng)選用含血液的部分或較為可疑的實(shí)體部分,滴上伊紅后,用皺紋紙包好,用10%的中性甲苯固定,再經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟并包埋。新鮮的胃液、尿液、胸腹水等體液標(biāo)本,倒去上層的澄清液體,將下面渾濁的液體放人離心管中,以20003000r/min離心15min,倒去上清液后,以環(huán)保組織固定液固定下面的沉淀物,然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。(三快速石蠟包埋法本法適用于沒有冰凍切片設(shè)備,進(jìn)行術(shù)中病理診斷的單位,取材時(shí)注意應(yīng)小而且薄。主要過程如下。(1將組織放人環(huán)保組織固定液中(2人純丙酮I,3min。(3人純丙酮,3

20、min。(4人苯,2min。(5人石蠟,5min。(6快速包埋后切片、染色封固。(四冷凍干燥包埋法冷凍干燥包埋法的基本原理是將新鮮組織低溫速凍,再利用真空排除組織內(nèi)所有水分,使石蠟直接浸入組織內(nèi)而制成蠟塊。其優(yōu)點(diǎn)是可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì),防止蛋白質(zhì)變性和酶失活?；具^程:新鮮組織在液氮中速凍后,真空抽氣,以排除組織內(nèi)的水分,然后將充分干燥的組織用甲醛蒸氣固定,再將固定過的組織浸入石蠟內(nèi)浸蠟,最后石蠟包埋。此法包埋的蠟塊可用于免疫熒光和免疫酶標(biāo)記,也可用于放射自顯影及IGSS方法。 為了使石蠟完全取代組織中的透明劑,必須經(jīng)3次浸蠟,每次時(shí)間為1h左右。本實(shí)驗(yàn)室蠟的熔點(diǎn)一般為5658C,這種熔點(diǎn)

21、的蠟較適中,經(jīng)過此種石蠟浸透,包埋后切片順利,連續(xù)性好,展片平整。切片是免疫組化準(zhǔn)備工作的最后一步,其切片質(zhì)量相對(duì)于常規(guī)組織切片來說要求更高,要切得薄而平整,并注意不可有刀痕。主要有石蠟切片、冰凍切片、塑料包埋切片、碳蠟切片等。在切片前還需對(duì)載玻片進(jìn)行相應(yīng)的處理。一、載玻片的處理免疫組化染色時(shí)間長(zhǎng),特別是雙PAP、免疫金銀染色等方法,所需時(shí)間更長(zhǎng),并要反復(fù)洗滌,切片在試劑中長(zhǎng)時(shí)間浸泡,經(jīng)多次洗滌,極易造成脫片而影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。需采用以下方法處理:載玻片先臵于洗潔液(或洗衣粉溶液中煮沸30min,清水洗干凈后放人清潔液中浸泡1224h,漂洗,用蒸餾水清洗后臵于烤箱內(nèi)干燥,然后涂以切片黏合劑。切片

22、黏合劑的配制方法如下。(1明礬明膠的配制方法明礬、明膠各1g,加入到100ml1%甘油中,加熱至70C熔化,并攪拌混合至完全透明狀,將切片浸入此液中幾分鐘,也可以涂在載玻片上,362h后即可使用。(2合成乳膠聚醋酸乙烯乳液的配制方法合成乳膠是一種高分子乳化聚合物,具有高度黏合力,無毒、無臭、無腐蝕性。取合成乳膠10份,加蒸餾水90份,攪拌成10%的使用液備用。載玻片可以浸泡此液中,也可以涂片。浸泡時(shí)濃度最好稀一點(diǎn);用于涂片最好濃度高一點(diǎn),涂完后在36C中5h后即可使用。(3多聚賴氨酸0.05%多聚賴氨酸(分子質(zhì)量200kDa水溶液,臨用時(shí)現(xiàn)配,電吹風(fēng)吹干即可使用。(4進(jìn)口切片黏合劑此膠屬樹脂膠

23、,國外作為木材的黏合劑。涂膠方法同(1,即直接涂片或浸入涂片。一般買回來的黏合劑需10%稀釋。(5甲醛明膠1%明膠5mi,2%甲醛5ml,混合即可涂片。(6明膠鉻明礬戊二醛黏合劑載玻片在10%Extron中65清洗60min,用熱水沖洗60min,雙重蒸餾水洗2次,空氣干燥,然后浸在0.5%明膠0.05%鉻明礬液(注:先將0.5%明膠60C溶解,冷卻后加入鉻明礬中,40C浸浴lmin,空氣干燥,用0。2%戊二醛(PBS配制固定60min,PBS洗后,切片空氣干燥,于4C保存。(7白膠多聚賴氨酸混合液取進(jìn)口切片黏合劑10ml,加10mg多聚賴氨酸混勻,即可用于涂片。二、石蠟切片石蠟切片不僅是常規(guī)

24、病理中的重要切片形式,也是免疫組化研究中較常用的切片形式,它能滿足免疫組化的連續(xù)切片要求。為了便于染色及觀察,切片時(shí)應(yīng)注意:連續(xù)切片時(shí)應(yīng)按順序分離及貼片,不應(yīng)顛倒;貼片時(shí)應(yīng)距載玻片一端至少1cm,一般靠一邊,以利于顯色安全;用于免疫組織化學(xué)染色的蠟溫應(yīng)為5658,切片水溫在40左右,應(yīng)先臵于冷水中,然后再移人熱水中,這樣可以使切片能順利展平;切片刀要求快,切片要薄,無刀痕和皺褶,在染色時(shí)可減少非特異染色;烤片時(shí)要注意,抗原性較強(qiáng)的組織可在60烤38h,抗原較弱的組織可于37恒溫箱內(nèi)過夜;切片如需長(zhǎng)期保存,可臵于4或室溫下,千萬不可脫蠟后4保存,因脫蠟后失去了對(duì)抗原決定簇的保護(hù)。三、冰凍切片冰凍

25、切片的優(yōu)點(diǎn)是能較完整地保存抗原性。組織細(xì)胞的某些抗原成分,特別是細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及肽類抗原在石蠟切片的處理過程中,可不同程度遭受破壞或失去抗原性,而冰凍切片就能最大限度地保護(hù)抗原。缺點(diǎn)是在冷凍過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)可能破壞,抗原易彌散,不能用于常規(guī)病檢及回顧性研究。如希望保存較長(zhǎng)時(shí)間和避免抗原彌散,可用環(huán)保組織固定液在4度固定5-10min。目前大多采用恒冷箱冰凍切片機(jī),將新鮮組織臵于-25左右的恒冷箱中,待組織完全冷凍后即可連續(xù)切片。其注意事項(xiàng):切片刀要快,并且預(yù)先冷凍,恒冷箱的溫度一般調(diào)至-25左右,不能太低,否則組織表面易出現(xiàn)冰渣;抗卷板的位臵要適中,否則難成片;貼片時(shí)動(dòng)作輕而迅速,否則

26、易出現(xiàn)皺褶;組織從液氮內(nèi)或-80取出,必須進(jìn)行溫度平衡后才能切成片,切完的組織如下次還用,應(yīng)用冷凍頭在沒有完全溶解前取下,密閉后低溫保存。切片后,應(yīng)用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干或自然干燥。如在短時(shí)間內(nèi)用,可全部進(jìn)行固定,固定后,PBS 洗,吹干后低溫冰箱內(nèi)保存。四、碳蠟切片碳蠟切片與石蠟切片相似,碳蠟是水溶性蠟,因此切片時(shí)不需用水展片,只需貼在載玻片上,吹干即可。切好片應(yīng)把碳蠟塊密閉保存在干燥器內(nèi)。另外,碳蠟切片不需脫蠟至水,切片可直接入水進(jìn)行各種染色。免疫組化石蠟切片的脫蠟石蠟切片脫蠟這個(gè)步驟,操作時(shí)經(jīng)常被忽視,其實(shí)這是很重要的一個(gè)步驟,脫蠟是否完全直接影響后面的抗原抗體結(jié)合。常規(guī)是切片放在二甲苯中3-

27、5min,兩次,必要時(shí)可升高溫度,尤其是沒有使用低熔點(diǎn)石蠟包埋的切片。因?yàn)槎妆蕉拘员容^大,刺激性特別強(qiáng),需在通風(fēng)柜中操作,少部分同仁為了盡量縮短接觸二甲苯的時(shí)間,導(dǎo)致脫蠟不完全?，F(xiàn)在國外實(shí)驗(yàn)室大多不使用xylene二甲苯這個(gè)有毒試劑,而改用環(huán)保組織透明液,可在普通實(shí)驗(yàn)臺(tái)上操作,可確保脫蠟完全。很多國外文章漂亮的片子,都是這些細(xì)節(jié)決定的喔!石蠟切片免疫組化染色步驟1、載玻片的處理:抗原修復(fù)過程中,由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行,可選用我公司提供的ZLI-9001APES、ZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005Poly-L-Lysine

28、等幾種試劑,對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下:1.1APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留2030秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES,臵通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結(jié)果。1.2HistogripTM:將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留12分鐘,然后用雙蒸水快速清洗三次,室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時(shí),裝盒備用。1.3Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,

29、60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。2、常用酶消化:2.1胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%0.1%,消化時(shí)間為37、1040分鐘,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。2.2胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時(shí)間為37、30180分鐘,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白,Collagen IV(IV型膠原等。2.3g/ml的saponin溶液,消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。m皂素(Saponin:一般使用濃度為2103、抗原熱修復(fù):如果組織固定沒有使用甲醛類固定液,使用的是環(huán)保組織固定液,如西奈山環(huán)保組織固定液,一般情況下,可省去抗原修

30、復(fù)過程,因非醛類固定液,不對(duì)蛋白形成大量的交聯(lián),不會(huì)掩蓋抗原族。3.1石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,3%H2O2處理10分鐘,蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液的容器中,臵微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在9298之間并持續(xù)1015分鐘(注意:無論是使用醫(yī)用或家用微波爐,請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)臵條件,務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求。取出容器,室溫冷卻1020分鐘(注意:不可將切片從緩沖液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。3.2石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml3000ml的

31、枸櫞酸鹽緩沖液(工作液注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片臵于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)(約加熱56分鐘后,計(jì)時(shí)12分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS 洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。3.3石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法:切片脫蠟至水后,放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液的容器中,并將此容器臵于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達(dá)9298起開始計(jì)時(shí)1520分鐘,然后端離電爐,室溫冷卻2030分鐘,蒸餾水沖洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。4、免疫組化染

32、色步驟:(以美國ZYMED公司SP試劑盒為例1石蠟切片脫蠟至水。23%H2O2室溫孵育510分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。3蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,(如需采用抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行。4510%正常山羊血清(PBS稀釋封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37孵育12小時(shí)或4過夜。5PBS沖洗,5分鐘×3次。6滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋,37孵育1030分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37或室溫孵育1030分鐘。7PBS沖洗,5分鐘×3次。8滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS

33、稀釋,37孵育1030分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37或室溫孵育1030分鐘。9PBS沖洗,5分鐘×3次。10顯色劑顯色(DAB或AEC。11自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。冰凍切片免疫組化染色步驟室溫放臵30分鐘后,入4丙酮固定10分鐘,PBS洗,5分鐘×3。用3%過氧化氫孵育510分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗,5分鐘×2免疫組化實(shí)驗(yàn)過程中的要點(diǎn)和技巧1.固定:常用4%的多聚甲醛固定液,最好用環(huán)保組織固定液,安全,無毒。對(duì)于冰凍切片,環(huán)保組織固定液有更好的優(yōu)越性;但對(duì)于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而

34、推薦的固定液,請(qǐng)于購臵前注意說明書。Bouin S固定液:飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。PLP液:即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。2.組織脫水,透明:時(shí)間不能太長(zhǎng),應(yīng)用新型環(huán)保組織透明液,不含二甲苯等有毒試劑,可避免切片時(shí)容易碎片,切不完整。3.切片時(shí)展片:有些組織在切片后難以在水中展開,這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?.烤片:6030分鐘或37過夜,溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原容易丟失。5

35、.蠟塊及切片的保存:最好在4保存6.脫片問題:Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,可用雙重處理(APES和Poly-L-Lysine的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切片在脫蠟前,放在APES1:50丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步。7.滅活內(nèi)源性酶:HRP系統(tǒng):3%雙氧水滅活;AP系統(tǒng):3%HAc滅活。8.暴露抗原:對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加

36、免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的最佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書。對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。9.封閉:在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉10.抗體稀釋:應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。11.背景高:在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗。12.返藍(lán):在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液(如PBS或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。13.顯色:一定要在顯微鏡下觀察

37、,注意控制背景。14.在整個(gè)操作過程中,切片千萬不能干燥,否則會(huì)有非特異性染色。免疫組織化學(xué)組織細(xì)胞的組織浸蠟組織經(jīng)過脫水、透明后臵人石蠟中,使組織變硬而利于切片的過程稱為浸蠟。 免疫組化操作制度1、設(shè)臵單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室。2、必須有專用的冰箱,天平和pH計(jì),并定期校對(duì)。3、實(shí)驗(yàn)用玻片,器皿必須清潔。經(jīng)過泡酸處理,清洗干凈。4、即用型試劑必須放入4度冰箱內(nèi),并每天對(duì)冰箱溫度進(jìn)行檢查并登記(包括-80度和-20度冰箱。5、試劑在有效期內(nèi)使用(自己配制的試劑,也需標(biāo)明有效期,使用前必須核對(duì)有效期。6、專用的脫蠟,脫水流程。7、設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。8、根據(jù)各種抗體具體要求進(jìn)行抗原修復(fù)。9、新抗體必須摸索出

38、最佳稀釋度。10、孵育時(shí)間,溫度根據(jù)各種抗體的具體要求操作。11、DAB顯色必須在鏡下觀察。12、復(fù)染后經(jīng)酒精充分脫水,環(huán)保組織透明液透明濕封。13、封片時(shí)不得有氣泡,不得有樹膠外溢。14、標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè),編號(hào)字跡必須清楚。15、制片工作一般應(yīng)在48小時(shí)內(nèi)完成。16、切片完成后交付醫(yī)師時(shí)必須按照記錄當(dāng)面清點(diǎn)。17、對(duì)使用的免疫組化抗體進(jìn)行克隆號(hào)、稀釋比、配制時(shí)間記錄。免疫組化抗原修復(fù)選擇應(yīng)用抗原修復(fù)技術(shù)一般用于經(jīng)甲醛固定的石蠟切片標(biāo)本中,經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞在進(jìn)行免疫組化染色時(shí)其敏感性明顯降低,其原因(1(1再用甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉了部分抗原決定族;(2甲醛在保存過程中會(huì)形成

39、羧甲基,而封閉抗原決定族;(3在用固定劑固定時(shí),會(huì)使蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián),也可能會(huì)封閉抗原決定族。因此,在染色時(shí),有些抗原須經(jīng)修復(fù)或暴露即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。因此免疫組化推薦使用不含醛的環(huán)保組織固定液常用抗原修復(fù)方法:1.檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法(1適用范圍:適用于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù),其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法。(2儀器設(shè)備:普通家用壓力鍋、電爐、不銹鋼或耐高溫塑料切片架。(3試劑:0.01M 檸檬酸型緩沖液,pH6.0。(4操作步驟:常規(guī)組織切片經(jīng)環(huán)保組織透明液脫蠟、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事項(xiàng):加

40、熱時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要,從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源總時(shí)間控制在5-8分鐘為好,時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架,不能使用銅架,以防緩沖液pH值增高導(dǎo)致組織脫片。高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷卻后,才能把切片取出。為防止組織脫片,玻片必須經(jīng)清潔處理后,包被0.01%多聚賴氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丟失。用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。2.檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法(1適用范圍:同方法1。(2儀器設(shè)備:微波爐、耐高溫塑

41、料切片架。(3試劑:0.01M檸檬酸型緩沖液,pH6.0。(4操作步驟:常規(guī)組織切片經(jīng)環(huán)保組織透明液脫蠟、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事項(xiàng):微波加熱時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要,從組織切片放入緩沖液到微波結(jié)束總時(shí)間控制在15-20分鐘為好,時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。必須使用耐高溫塑料切片架,不能使用銅架或不銹鋼。微波過程中,如果緩沖液蒸發(fā)而量減少,無法浸泡到組織片,應(yīng)該適當(dāng)加上一些蒸餾水,以保證組織片都能浸泡在緩沖液中,繼續(xù)微波。微波結(jié)束后,必須等緩沖液冷卻后,才能把切片取出。為防止組織脫片,玻片必須經(jīng)清潔處理后,包被0.01%多聚賴氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopr

42、opyl-triethoxy silane。緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丟失。用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。3.檸檬酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)法(1適用范圍:同方法1,效果最差。(2儀器設(shè)備:電爐、燒杯(1000ml、不銹鋼或耐高溫塑料切片架。(3試劑:0.01M檸檬酸型緩沖液,pH6.0。(4操作步驟:常規(guī)組織切片經(jīng)環(huán)保組織透明液脫蠟、梯度酒精水化至水,待用;(3注意事項(xiàng):煮沸時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要,從組織切片放入緩沖液到燒杯離開電爐總時(shí)間控制在20分鐘為好,時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架,不能使用銅架,以防緩沖液pH值增高導(dǎo)致組織

43、脫片。微波結(jié)束后,必須等緩沖液冷卻后,才能把切片取出。為防止組織脫片,玻片必須經(jīng)清潔處理后,包被0.01%多聚賴氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丟失。用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。4.EDTA抗原熱修復(fù)法水浴法(1適用范圍:同方法1。(2儀器設(shè)備:鋁鍋或鐵鍋、電爐、燒杯(1000ml、不銹鋼或耐高溫塑料切片架。(3試劑:1mM EDTA抗原修復(fù)液pH8.0。(4操作步驟:常規(guī)組織切片經(jīng)環(huán)保組織透明液脫蠟、梯度酒精水化至水,待用;取一定量1mM EDTA抗原

44、修復(fù)液pH8.0于燒杯中,放入鋁鍋或鐵鍋,蓋上鍋蓋進(jìn)行熱煮(注意防止EDTA液從燒杯中倒出直至鍋中水沸騰(此時(shí)燒杯內(nèi)的EDTA液不會(huì)沸騰;將脫蠟水化后的組織切片臵于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,繼續(xù)煮沸20分鐘,煮好后從鍋中取出燒杯冷卻至室溫,取出切片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS(pH7.2 -7.4沖洗兩次,每次3分鐘。進(jìn)行組化的下一步。(3注意事項(xiàng):微波結(jié)束后,必須等緩沖液冷卻后,才能把切片取出。為防止組織脫片,玻片必須經(jīng)清潔處理后,包被0.01%多聚賴氨酸(poly-L-lysine或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane。緩沖液的量必須

45、保證所有切片都能浸泡到,避免切片干涸(抗原可能完全丟失。用過的EDTA緩沖液不能反復(fù)使用。5.酶消化法抗原修復(fù)法(常用胰蛋白酶和胃蛋白酶(1適用范圍:同方法1,酶消化可以大大增強(qiáng)免疫組化染色效果。胰蛋白酶(trypsin一般為0.05%0.25%,常用0.125%。胃蛋白酶(pepsin常用0.4%。(2操作步驟:常規(guī)組織切片經(jīng)環(huán)保組織透明液脫蠟、梯度酒精水化至水,;阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(也可以在消化處理后進(jìn)行阻斷,用PBS(pH7.2-7.4沖洗3次,每次3分鐘。用吸水紙吸干組織周圍的水分,界限筆沿組織外周劃圈,再滴加酶消化, 3715-20分鐘(注意加酶前保持組織濕潤(rùn),不能干,加酶后注意不

46、要使液體流出圓圈外,酶消化時(shí)間可以根據(jù)情況調(diào)節(jié),PBS沖洗3分鐘×3次,進(jìn)行組化的下一步。(3注意事項(xiàng):配好的消化酶溶液至4-8冰箱保存,避免冰凍。免疫組化石蠟切片脫水用乙醇,而冰凍切片為何用蔗糖溶液,需進(jìn)一步探討免疫組化組織細(xì)胞固定過程常見問題與原因1、問題:組織固定不佳.原因:(1固定的容器過小或標(biāo)本數(shù)量過多。(2組織取材過大、過厚。(3固定時(shí)間不足。(4固定液濃度不夠或已失效。(5組織漂浮在固定液面(如肺臟,沒有達(dá)到固定目的。(6固定液用量不足,與組織比例未達(dá)到51以上。2、問題:因固定原因引起的染色困難。原因:(1固定液選擇不當(dāng)。(2酸性固定液中固定時(shí)間過久。3、問題:組織扭

47、曲變形。原因:(1所取組織過薄。(2胃、腸、膽囊等空腔臟器固定時(shí)未用厚紙片敷墊,而使卷曲。(3組織過多而互相擠壓變形。由于標(biāo)本固定不當(dāng)所出現(xiàn)的問題,雖然有些補(bǔ)救辦法,但所有的辦法都不能得到滿意的結(jié)果,而可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。最根本的是要細(xì)心操作,杜絕上述問題免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果判斷,除了鑒別腫瘤細(xì)胞陽性或陰性顯色外,還必須仔細(xì)觀察腫瘤細(xì)胞陽性著色程度、陽性顆粒定位和分布、陽性細(xì)胞數(shù)量、陽性標(biāo)記的組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、特異性與非特異性染色,注意識(shí)別抗體交叉反應(yīng)和腫瘤異常表達(dá),并結(jié)合腫瘤本身固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)和腫瘤標(biāo)記物的標(biāo)記譜系,加以綜合分析。因此,免疫組化標(biāo)記同樣具有其形態(tài)學(xué)特點(diǎn),若能熟練掌握則有助

48、于正確判斷。一、陽性標(biāo)記色度特征免疫組化標(biāo)記結(jié)果的顯色反應(yīng)與所采用的方法和選擇的底物相關(guān)。目前國內(nèi)診斷免疫組化多采用免疫酶方法,通常為辣根過氧化物酶,底物為DAB,故陽性反應(yīng)為黃色。腫瘤細(xì)胞陽性著色程度取決于抗原含量、分布密度和標(biāo)記方法及其敏感性。一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,標(biāo)記方法越敏感,陽性結(jié)果顯色則越強(qiáng)。根據(jù)陽性標(biāo)記的顯色程度分為:淡黃色,提示為弱抗原;棕黃色,為中等度抗原;棕黑色,示為強(qiáng)抗原。在結(jié)果判斷中,后兩者較有意義,可作為判斷依據(jù)。而前者除考慮標(biāo)本處理和方法學(xué)因素外,可能與腫瘤在分化過程中輕度異常表達(dá),或某些惡性腫瘤細(xì)胞攝取了周圍組織抗原之故,若將其作為腫瘤組織學(xué)來源的

49、依據(jù)應(yīng)十分謹(jǐn)慎。此外,按其顏色的折光度,表現(xiàn)為暗棕色和亮棕色兩種。所謂暗棕色即為灰暗的棕色反應(yīng),色質(zhì)欠鮮艷而發(fā)灰,常見于某些神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和神經(jīng)鞘瘤中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE、S-100蛋白、神經(jīng)絲蛋白和突觸素等,可能與這些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生某種化學(xué)物質(zhì)與底物酶或DAB 作用有關(guān)。大部分標(biāo)記呈亮棕色,即結(jié)果顯示耀眼的棕色反應(yīng),色質(zhì)較鮮艷,如上皮性腫瘤、間葉性腫瘤和淋巴瘤等大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分蛋白常為此種表現(xiàn)。二、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征是反映抗原在細(xì)胞中的定位和分布情況。決定抗原在細(xì)胞中的定位除了與腫瘤細(xì)胞本身表達(dá)部位有關(guān)外,還與組織標(biāo)本固定效果、抗體的特異性和交叉反應(yīng)相關(guān)。組織固定

50、不佳除了會(huì)使抗原破壞和丟失外1,可造成抗原移位;抗體特異性差、純度不夠或嚴(yán)重交叉反應(yīng)。這些都會(huì)導(dǎo)致背景染色加重而影響抗原在細(xì)胞中的定位。在腫瘤診斷中陽性細(xì)胞以擬標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞為前提,陽性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的陽性表達(dá)和非腫瘤細(xì)胞即使是陽性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。根據(jù)抗原在腫瘤細(xì)胞中分布和陽性顆粒沉淀部位分為5種類型:(1胞膜型:陽性顆粒主要分布于細(xì)胞膜表面,形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個(gè)細(xì)胞。一般良性腫瘤黃色膜層較完整,厚薄均勻而規(guī)則。惡性腫瘤則深淺不一,厚薄不均,部分瘤細(xì)胞或細(xì)胞膜部分區(qū)域缺如。此類型常見于某些膜抗原,如上皮膜抗原(EMA、上皮特異性抗原(ESA、上皮腫

51、瘤相關(guān)抗原(結(jié)腸癌相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)粘液抗原、卵巢癌抗原等(2、間皮細(xì)胞抗原(HMBE-1、淋巴細(xì)胞抗原中白細(xì)胞共同抗原(LCA、B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞相關(guān)抗原(GAA、Ki-1等。值得注意的是,某些膜抗原對(duì)于不同腫瘤其表達(dá)方式有一定差異,判斷時(shí)應(yīng)引起注意。(2胞核型:陽性顆粒定位于細(xì)胞核。它可以均勻地分布于整個(gè)胞核,也可位于核膜下,有的呈小斑塊狀不規(guī)則分布,多見于增殖細(xì)胞核抗原(PCNA、PANA、Ki-67、有絲分裂蛋白(MPM,激素受體中雌激素受體(ER、孕激素受體(PR,基因p53等。增殖細(xì)胞核抗原和某些癌基因,視腫瘤細(xì)胞良惡性和增殖情況,其染色強(qiáng)度和分布形式有異。良性增殖細(xì)胞多為淡黃

52、色,顆粒細(xì)胞均勻,分布于整個(gè)細(xì)胞核;而惡性增殖細(xì)胞核深淺不一,顆粒粗細(xì)不等,部分顆粒聚積呈小塊狀且分布不均,當(dāng)然核大小和核形態(tài)也顯著異型。這些特點(diǎn)同樣有助于良惡性腫瘤的判斷,尤其對(duì)于淋巴瘤和交界性腫瘤的診斷具有重要意義。(3胞漿型:陽性顆粒主要分布于細(xì)胞漿。大部分抗原均屬于此種類型,如細(xì)胞角蛋白、前列腺特異性抗原(PSA、前列腺酸性磷酸酶(PSAP、癌胚抗原(CEA、波形蛋白、結(jié)蛋白、神經(jīng)絲蛋白、肌紅蛋白、1-抗胰糜蛋白酶等中間絲及細(xì)胞成分相關(guān)蛋白多數(shù)位于細(xì)胞漿。但同一種標(biāo)記在不同的腫瘤中的表現(xiàn)形式則有異。依據(jù)抗原在胞漿內(nèi)分布形式,通常表現(xiàn)為彌漫和局限性兩種。前者陽性顆粒彌漫而均勻地分布于整個(gè)

53、細(xì)胞漿,包括胞體和突起。局限性是指陽性顆粒呈小斑點(diǎn)狀或斑塊狀局限于細(xì)胞漿中的某一部位,核周或細(xì)胞漿的一側(cè)等。某些神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤表達(dá)細(xì)胞角蛋白和波形蛋白。某些肌源性腫瘤中結(jié)蛋白,腦垂體腫瘤中催乳素(PRL和生長(zhǎng)激素(GH常見到這種局限性分布形式。細(xì)胞漿陽性顆粒粗細(xì)與腫瘤本身類型有關(guān),如惡性組織細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤和某些神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等顆粒較粗;上皮腫瘤、肌源性腫瘤及神經(jīng)鞘瘤等顆粒相對(duì)較細(xì)。(4微絨毛型:抗原顆粒主要分布于腺癌細(xì)胞的微絨毛,而胞漿和胞膜可以是陽性或陰性表達(dá)。這種表現(xiàn)形式最常見于各種腺癌,如甲狀腺癌、乳腺癌、胃腸腺癌、膽道腺癌,卵巢漿液性腺癌等。其特點(diǎn)是陽性顆粒除靠近腔面陽性外,其余

54、基底部可呈陰性反應(yīng)。在腫瘤標(biāo)記物中多見于上皮膜抗原、上皮特異性抗原、結(jié)腸癌相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)粘液抗原和卵巢癌抗原等。甲狀腺腺癌中甲狀腺球蛋白常以該形式出現(xiàn)。間皮細(xì)胞瘤中HMBE-1也可見微絨毛表達(dá)。但惡性腫瘤中并非所有腫瘤細(xì)胞都表達(dá),僅見于部分腺體或部分區(qū)域的腫瘤細(xì)胞。(5復(fù)合型:在常規(guī)免疫組化標(biāo)記中,同一種抗原可以同時(shí)表達(dá)于胞膜和胞漿、胞核和胞漿、微絨毛和胞漿,但很少發(fā)現(xiàn)胞膜和胞核同時(shí)表達(dá)。上皮膜抗原在腺癌中除顯示膜陽性外,許多情況下胞漿也呈陽性反應(yīng)。上皮特異性抗原多數(shù)為膜陽性,但在胃腸腺癌、精原細(xì)胞瘤等可顯示胞漿陽性。這是由于細(xì)胞漿內(nèi)有較多膜系結(jié)構(gòu),故陽性顆?？赏瑫r(shí)定位于細(xì)胞膜和胞漿。結(jié)腸

55、癌相關(guān)抗原在胃腸腺癌、乳腺癌相關(guān)抗原在乳腺癌和甲狀腺癌、卵巢癌抗原在卵巢漿液性腺癌中,除腔面微絨毛強(qiáng)陽性表達(dá)外,有時(shí)胞漿也呈陽性反應(yīng)。某些標(biāo)記物如GAA 在粒細(xì)胞和R-S細(xì)胞為膜表達(dá),而胃腸腺癌則為胞漿表達(dá);組織細(xì)胞抗原呈組織細(xì)胞膜陽性,某些肺癌則見于細(xì)胞漿;間皮細(xì)胞抗原對(duì)于間皮細(xì)胞表現(xiàn)為膜陽性,而腺癌雖也陽性,但常見于細(xì)胞漿3。另一些抗原分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,故細(xì)胞核和漿同時(shí)陽性。最常見的標(biāo)記為S-100蛋白、黑色素瘤相關(guān)抗原(HMB45。無論是星形細(xì)胞瘤、唾液腺肌上皮瘤、還是神經(jīng)鞘瘤和黑色素瘤等S-100均可同時(shí)顯示胞漿和胞核陽性。HMB45在惡性黑色素瘤中亦是如此。有時(shí)PCNA在部分Ho

56、dgkin病和個(gè)別胃腸腺癌胞漿可呈弱陽性反應(yīng),雌激素調(diào)節(jié)蛋白在乳腺癌可同時(shí)定位于胞漿和胞核。此外,組織標(biāo)本固定不及時(shí)造成抗原移位,或乳腺癌中ER和PR修復(fù)不充分也可以發(fā)生核和漿同時(shí)陽性三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征腫瘤免疫組化標(biāo)記的組織學(xué)特點(diǎn)與下列因素相關(guān):(1腫瘤自身組織學(xué)結(jié)構(gòu),如上皮性腫瘤陽性細(xì)胞常呈團(tuán)塊狀和腺管狀,淋巴瘤多為彌漫性結(jié)構(gòu);(2腫瘤細(xì)胞分化程度,免疫組化結(jié)構(gòu)有時(shí)與HE結(jié)構(gòu)并非完全一致,如低分化腫瘤可表現(xiàn)為不規(guī)則斑片狀或局灶性陽性;(3腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的特定部位情況,如LCA、B細(xì)胞、T細(xì)胞等膜抗原在淋巴瘤中常表現(xiàn)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)腫瘤免疫組化陽性細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為局灶型、彌漫型、片

57、塊型、網(wǎng)狀型、腺管狀型和菊?qǐng)F(tuán)型等。1.局灶型:陽性瘤細(xì)胞呈不規(guī)則小灶性分布。陽性細(xì)胞可多可少,排列不規(guī)則,無固定排列形式,陽性染色深淺不一。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞分化的不一致性之故。細(xì)胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和癌肉瘤;肌動(dòng)蛋白(MSA和結(jié)蛋白在低分化橫紋肌肉瘤; NSE、神經(jīng)絲蛋白、突觸素在惡性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,低分化星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中膠質(zhì)纖維酸性蛋白,惡性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表現(xiàn)為局灶性陽性。此種情況若發(fā)生在細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞成分蛋白則提示該腫瘤分化程度較低。某些惡性腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)或向某一組織細(xì)胞分化也常表現(xiàn)為局灶性陽性,如胃腸腺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌表達(dá),平滑肌和神經(jīng)鞘瘤向上皮分化等。2.彌漫型:陽性細(xì)胞呈彌漫性分布,細(xì)胞間無連接,也可以單個(gè)細(xì)胞散在分布。淋巴造血腫瘤中Hodgkin病、部分淋巴瘤和組織細(xì)胞瘤常彌漫性分布;上皮性腫瘤中胃腸未分化癌也表現(xiàn)為彌漫性,但有時(shí)可見條索狀結(jié)構(gòu);神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中分化較好的腫瘤細(xì)胞可見彌漫性結(jié)構(gòu)。因此,彌漫性結(jié)構(gòu)常見于小圓細(xì)胞腫瘤,而且這些腫瘤細(xì)胞幾乎都高度表達(dá)某種抗原,如淋巴瘤(LCA、B細(xì)胞、T細(xì)胞,Hodgkin病(粒細(xì)胞相關(guān)抗原、Ki-1,胃腸未分化癌癌胚抗原(CEA、上皮膜