半數(shù)致死量的測定

1、Reed-Muench法物受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體，并與相應的病毒粒子呈現(xiàn)特異性結(jié)合，因而阻止病毒對敏感細胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和試驗 (Neutralization Test)是以測定病毒的感染力為基礎，以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，來判定免疫血清中和病毒的能力。中和試驗常用的有兩種方法：一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數(shù)稀釋(即十倍遞次稀釋)的病毒混合；然后把血清病毒混合物置適當?shù)臈l件下感作一定時間后，接種于敏感細胞、雞胚或動物，測定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效價。如果接種血清病毒混合物

2、的宿主與對照(指僅接種病毒的宿主)一樣地出現(xiàn)病變或死亡，說明血清中沒有相應的中和抗體。中和反應不僅能定性而且能定量，故中和試驗可應用于：1.病毒株的種型鑒定：中和試驗具有較高的特異性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清，即可測知相應血清或病毒的型，所以，中和試驗不但可以定屬而且可以定型。2.測定血清抗體效價：中和抗體出現(xiàn)于病毒感染的較早期，在體內(nèi)的維持時間較長。動物體內(nèi)中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。毒素和抗毒素亦可進行中和試驗，其方法與病毒中和試驗基本相同。用組織細胞進行中和試驗，有常量法和微量法兩種，因微量法簡便，結(jié)果易于判定，適于作大批量試驗，

3、所以近來得到了廣泛的應用。(一) 定血清稀釋病毒法(病毒中和試驗)1.病毒毒價的測定毒價單位：衡量病毒毒價(毒力)的單位過去多用最小致死量(MLD)，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內(nèi)能致全組試驗動物死亡的最小劑量。但由于劑量的遞增與死亡率遞增不呈線性關(guān)系，在越接近100死亡時，對劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50時，對劑量的變化越敏感，故現(xiàn)多改用半數(shù)致死量(LD50)作為毒價測定單位，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內(nèi)能致半數(shù)試驗動物死亡的劑量。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感染量 (EID50)。用細胞培養(yǎng)測

4、定時，用組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時，則用半數(shù)免疫量(IMD50)或半數(shù)保護量(PD50)。(1) LD50的測定(以流行性乙型腦炎病毒為例)。測定方法：將接種病毒，并已發(fā)病瀕死的小鼠，無菌法取腦組織，稱重、加稀釋液充分研磨，配制成10-1懸液，3 000r/min離心20分鐘，取上清液，以10倍遞次稀釋成10-1、10-2、10-3 10-9，每個稀釋度分別接種5只小鼠，每只腦內(nèi)注射0.03ml，逐日觀察記錄各組的死亡數(shù)。表2-24LD50的計算（接種劑量為0.03ml）病毒稀釋度接種鼠數(shù)活鼠數(shù)死鼠數(shù)積累總計死亡比死亡率(%)活鼠死亡10-450501515/1

5、510010-550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/10010-95501500/150LD50的計算：按Reed和Muench氏法計算。高于50%的死亡分數(shù)-50%83%-50%距離比例= = =0.5高于50%的死亡百分數(shù)-低于50%的死亡百分數(shù)83%17%LD50的對數(shù)=高于50%病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)本例高于50%病毒稀釋度的對數(shù)6，距離比例為0.5，稱釋系數(shù)的對數(shù)為1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(1)=6.5則LD50=10-6.5，0.03ml，即該病毒作10-6

6、.5稀釋，接種0.03ml能使半數(shù)小鼠發(fā)生死亡。注意：稀釋血清法中和試驗，計算TCID50或LD50，MID50時，計算公式應改為：TCID50的對數(shù)=高于50%血清稀釋度的對數(shù)距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。如按Karber氏法計算，其公式為：IgLD50（或TCID50）=L+d(S0.5)L為病毒最低稀釋度的對數(shù)，d為組距，即稀釋系數(shù)，S為死亡比值的和。本例L=4，d=1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=4+(1)×(30.5)=6.5則LD50=10-6.5，0.03ml注意：用本法計算稀釋血清中和試驗中和效價時，S應為保護比值之和2)EID50的測定（以新城

7、疫病毒為例）將新鮮病毒液體10倍遞次稀釋法釋成10-1、10-2、10-310-9不同稀釋度，分別接種9-10日齡雞胚尿囊腔，雞胚必須來自健康母雞，并且沒有新城疫抗體。每只雞胚接種0.2ml，每個稀釋度接種6只雞胚為一組，以石蠟封口，置37-38培養(yǎng)，每天照蛋，24h之內(nèi)死亡的雞胚棄掉，24h之后死亡的雞胚置4保存。連續(xù)培養(yǎng)5天，取尿囊液作血球凝集試驗，出現(xiàn)血凝者判陽性，記錄結(jié)果，按上述方法計算 EID50。(3) TCID50的測定（以致細胞病變病毒為例）取新鮮病毒懸液，以10倍遞次稀釋成不同稀釋度，每個稀釋度分別接種經(jīng)Hanks液洗3次的組織細胞管，每管細胞接種0.2ml，每個稀釋度接種4

8、只細胞管，接種病毒后的細胞管放在細胞盤內(nèi)，細胞層一側(cè)在下，使病毒與細胞充分接觸，放置37吸附1h，加入維持液，置37培養(yǎng)，逐日觀察并記錄細胞病毒管數(shù)，按上述方法計算TCID50。2.中和試驗(1) 病毒稀釋度的選擇選擇病毒稀釋度范圍，要根據(jù)毒價測定的結(jié)果而定，如病毒的毒價為10-6，則試驗組選用10-210-8對照組選用10-410-8其原則是：最高稀釋度要求動物全存活（或無細胞病變），最低稀釋度動物全死亡（或均出現(xiàn)細胞病變）。(2)血清處理用于試驗的所有血清在用前須作5630min加溫滅活。但來自不同動物的血清，滅活的溫度和時間也是不同的。(3)病毒的稀釋按選定的病毒稀釋度范圍，將病毒液作1

9、0倍遞次稀釋，使之成為所需要的稀釋度。(4）感作將不同稀釋度病毒分別定量加入兩排無菌試管內(nèi)，第一排每管加入與病毒等量的免疫（或被檢）血清作為試驗組；第二排每管加入與免疫（或被檢）血清同種的正常陰性血清作為對照組；充分搖勻后放37感作12h。(5) 接種按“病毒價測定”中所述接種方法接種試驗動物（或雞胚、組織細胞）。觀察持續(xù)時間，根據(jù)病毒和接種途徑而定。(6)中和指數(shù)據(jù)計算物按Reed和Muench兩氏法（或Karber）法分別計算試驗組和對照組的LD50（或EID50、TCID50）試驗級LD50(EID50、TCID50)中和指數(shù) = 對照組LD50(EID50、TCID50)假如試驗組LD

10、50為10-2.2，對照組LD50為10-5.6。則中和指數(shù)為103.3，103.3=1 995，也就是說該待檢血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。(7)結(jié)果判定固定血清稀釋病毒法進行中和試驗，當中和指數(shù)大于50，表示補檢血清中有中和抗體；中和指數(shù)在10-50為可疑；若中和指數(shù)小于10為無中和抗體存在。(二) 固定病毒-稀釋血清法（血清中和試驗）1.病毒毒價的測定（微量法）(1) 病毒的制備將病毒接種于單層細胞，37吸附1h后加入維持液，置溫箱培養(yǎng)；逐日觀察，待細胞病變（CPE）達75%以上，收獲病毒懸液凍融或超聲波處理，以3 000r/min離心10min，取上清液，定量分裝成1ml小

11、瓶置-70保存?zhèn)溆?，選用的病毒必須是對細胞有較穩(wěn)定的致病力。(2) 病毒毒價測定取置-70冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作10倍遞進稀釋即10-1，10-2，10-11，每孔病毒懸液量為50l，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每塊板的最后一行設8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內(nèi)長滿單層為度。把培養(yǎng)板置5%CO2溫箱37培養(yǎng)，從48-14h逐日觀察細胞病變，記錄結(jié)果。按Reed和Muench兩氏法計算TCID50。56%-50%距離比例 = 56%-33%本例高于50%病毒稀釋度的對數(shù)為6，距離比例為0.26，稀釋系數(shù)的對數(shù)為1。表2-25 TCID50計算

12、（接種劑量50l）病毒稀釋度接種數(shù)CPE數(shù)無CPE數(shù)累計CPE率百分數(shù)(%)CPE無CPE10-288039039/3910010-388031031/3110010-487123123/249610-585315415/197910-684410810/185610-78446126/183310-88262182/201010-98080260/260IgTCID50 = 60.26×(1)= 6.3則TCID50=10-6.3，50即病毒作10-6.3稀釋，每孔接種50l，可使半數(shù)組織細胞管發(fā)生病變。2.中和試驗(1) 血清的處理動物血清中，含有多種蛋白質(zhì)成分對抗體中和病毒有輔

13、助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用于中和試驗的血清須經(jīng)加熱滅活處理。各種不同來源的血清，須采用不同溫度處理，豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60；水牛、狗及地鼠血清為62；馬兔血清為65；人和豚鼠血清為56。加熱時間為20-30min，60以上加熱時，為防止蛋白質(zhì)凝固，應先以生理鹽水作適當稀釋。(2) 稀釋血清取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養(yǎng)板上，用稀釋液作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量為50l，每個稀釋度作4孔。(3) 病毒取70冰箱保存的病毒液，按經(jīng)測定的毒價作200TC

14、ID50稀釋（與等量血清混合，其毒價為100TCID50）。如本例病毒價為10-6.3，50l。所以應將病毒作2×10-4.3稀釋。(4) 感作每孔加入50l病毒液，封好蓋，置于37溫箱中和1h。病毒與血清混合，0下，不發(fā)生中反應，4以上中和反應即可發(fā)生。常規(guī)采用37作用1h，一般病毒都可發(fā)生充分的中和反應。但對易于滅活的病毒可置4冰箱感作，根據(jù)不同耐熱性的病毒感作溫度和時間應有所不同。(5) 加入細胞懸液在制備細胞懸液時，其濃度以在24h內(nèi)長滿單層為度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100l細胞懸液。置5%CO2 37溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48h開始逐日觀察記錄，14h終判。由于各種病

15、毒引起細胞病變時間不同，終判時間應根據(jù)病毒致細胞病變的快慢而定。(6) 設立對照為保證試驗結(jié)果的準確性，每次試驗都必須設置下列對照，特別是在初次進行該種病毒的中和試驗時，尤為重要。陽性和陰性血清對照：陽性和陰性血清與待檢血清進行平行試驗，陽性血清對照應不出現(xiàn)細胞病變，而陰性血清對照應出現(xiàn)細胞病變。病毒回歸試驗：每次試驗每一塊板上都設立病毒對照相館，先將病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加50l。然后每孔100l細胞懸液。 0.1TCID TCID50應不引起細胞病變，而且100TCID TCID50必須引起細胞病變，否則該試驗不能成立。血清毒性

16、對照相：為檢查被檢血清本身對細胞有無任何毒性作用，設立被檢血清毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢血清（相當于中和試驗中被檢血清的最低稀釋度）。正常細胞對照相：即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整個中和試驗中一直保持良好的形態(tài)和生活特征，為避免培養(yǎng)板本身引起試驗誤差，應在每塊板上都設立這一對照。(7) 結(jié)果判定和計算當病毒回歸試驗，陽性、陰性、正常細胞對照相，血清毒性對照全部成立時，才能進行判定，被檢血清孔出現(xiàn)100%CPE判為陰性，50%以上細胞出現(xiàn)保護者為陽性；固定病毒稀釋血清中和試驗的結(jié)果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產(chǎn)生細胞病變的血清稀釋度，該稀釋度

17、即為該份血清的中和抗體效價。用Reed和Muench兩氏法（或Karber法）計算結(jié)果，如表2-2680%50%距離比例0.580%20%Ig TCID50=高于50血清稀釋度的對數(shù)距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)Ig TCID501.50.5×（0.3）1.35表2-26固定病毒稀釋血清法中和抗體效價計算血清稀釋CPE數(shù)總孔數(shù)CPE數(shù)無CPE數(shù)積累CPE比率百分數(shù)CPE無CPE1:4(10-0.6)0/4040120/1201:8(10-0.9)0/404080/801:16(101.2)1/413141/5201:32(10-1.5)3/431414/5801:64(101.8)4/440808/8100則T