單獨超薄切片課件

1、超薄切片一、 超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造和工作原理 目前有許多種型號的超薄切片機(jī)，但主要包括兩類： （1）熱脹式-工作原理：利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供前進(jìn)LKB公司的LKB-熱脹式切片機(jī)以該機(jī)型為例：其只要構(gòu)造：電源控制箱和主機(jī)部分。 （1）電源控制箱：樣品臂加熱及冷卻 樣品臂的升降控制 樣品臂的手動、自動模式 切削速度控制 （2）主機(jī)部分：樣品臂-帶加熱線圈和樣品定向頭 刀臺-可調(diào)整前后左右方位及角度 動圈式馬達(dá)-可使樣品臂上下往返運動 光源（熒光燈、聚光燈）-照明、觀察刀刃 立體顯微鏡-觀察切片超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造：主要由主機(jī)調(diào)控、對刀調(diào)節(jié)和觀察照明三大部分組成a.主機(jī)調(diào)控-

2、包括動力開關(guān)（ON/OFF）、手動切片控制鈕、自動切片控制鈕、加熱開關(guān)鈕、切速調(diào)控扭、切片厚度控制鈕和電吹風(fēng)開關(guān)等。b.對刀調(diào)節(jié)-包括樣品臂（它又包括樣品夾和調(diào)節(jié)樣品方向的一組鎳鈕等）、刀臺、刀角刻度指示（包括傾斜角和弧度角）、刀在水平方向左右移動和前后移動鈕，調(diào)節(jié)刀與樣品距離的組合鈕（包括粗調(diào)鈕、細(xì)調(diào)鈕、和微調(diào)鈕）等。c.觀察照明-包括滑動式顯微鏡底座、雙筒立體顯微鏡、日光燈白熾燈、顯微鏡傾斜度標(biāo)尺等。（2）機(jī)械式-工作原理：用微動螺旋和微動杠桿來提供微小前進(jìn)。常用的有LKB、LKB型和NOVA等，我國多用瑞典LKB公司產(chǎn)品，目前市場上新產(chǎn)品都是機(jī)械式超薄切片機(jī)。 二、切片前的準(zhǔn)備1、切片用

3、品包括解剖鏡、制刀機(jī)、玻璃條、載網(wǎng)、鑷子（細(xì)尖嘴）、培養(yǎng)皿、濾紙、睫毛筆、注射器（2或5ml）、重蒸水、95%乙醇、樣品盒、酒精燈、石蠟（塊或片）、綢布、小玻璃缸（直徑10cm，高10cm以上）、載玻片、新刀片（單面或雙面），以及制備支持膜的溶液（如：0.3%-0.5%孚爾瓦/氯仿溶液）等。2、修塊聚合好的樣品塊是不能直接拿到切片機(jī)上切片的，必須將其整修一番，去除外周的包埋介質(zhì)，暴露出表面積小于0.1mm，和低于0.2mm的小方臺。具體步驟：a. 把樣品快固定在樣品夾上，用解剖鏡觀察，先用鋒利的刀片在水平方向削，以去除樣品表面多余的樹脂，直到暴露出樣品。（一般看到切下的薄片中有黃褐色的痕跡時，

4、說明已切到組織或細(xì)胞了）b. 沿組織塊四周分別向斜下方（約30度角）傾斜切四刀，使包埋塊頭部形成一個立體梯形的平臺c. 在平臺上選一小塊面積（約0.1mm），期間充滿組織或細(xì)胞（即無空脂區(qū)域），并沿其四周分別再稍稍傾斜（約30度角）切四刀，使樣品塊平臺的上方暴露出一個高約0.2mm的小立方臺。注意如果小方臺過高，切片時容易連根碰掉；小方臺面積過大，不容易切出均勻和足夠薄的切片；并且小方臺表面至少要有兩條邊互相平行，這將有利于在切片時對刀。3、制刀：是指用制刀機(jī)制備玻璃刀的方法?？蛇x用鉆石刀（由天然鉆石加工而成）或玻璃刀（使用玻璃制作而成）進(jìn)行超薄切片。（1） 鉆石刀鉆石刀的質(zhì)量好，不用特意制備

5、，市售有多種型號供選擇，經(jīng)久耐用，切片時容易對刀和切出優(yōu)良的連續(xù)切片，特別適宜切質(zhì)地硬的樣品，如金屬、礦石、骨骼、厚細(xì)胞壁的植物材料等。但其價格昂貴，更需精心保護(hù)，注意使用前后作適當(dāng)?shù)那逑?。?） 玻璃刀玻璃刀制備簡單，價格低廉，目前多用制刀機(jī)裁制。但刀刃較脆，不耐用，適合初學(xué)者使用，用于切割質(zhì)地較軟的普通樣品。玻璃刀使用時需現(xiàn)用現(xiàn)做，通常一把刀切一個樣品就得放棄，一般都在使用前新鮮制成，以免沾然灰塵或碰壞，做好的玻璃刀在空氣中會有風(fēng)化作用，玻璃內(nèi)部的分子運動也會導(dǎo)致刀刃變鈍。1> 玻璃刀的制備：常用的是LKB 7800B型制刀機(jī)。制刀時，先把玻璃條洗凈晾干，制成方塊（如作45°

6、;刀）或者菱形塊（如作35°刀），然后，沿著稍偏離對角線的方向劃割，便可得到兩把三角形的刀。制刀過程要嚴(yán)格按照規(guī)定操作，動作要輕緩，切忌用力過猛，并注意及時清理制刀機(jī)臺面上的玻璃碎渣，以免影響刀的質(zhì)量。2> 玻璃刀檢查：按上述方法制成的玻璃刀，必須在解剖鏡下用聚光鏡的透射光照射或者用暗視野顯微鏡下檢查。道人平整光滑無鋸齒狀波紋者適用。3> 水槽的制作：經(jīng)檢查后的玻璃刀還須在刀上作一個小水槽，以便在切片時讓切下來的超薄切片漂浮在液面上，便于展平和撈片。水槽通常都是由預(yù)先成形的金屬片、塑料水槽（使用方便，只要蠟封住即可）或膠帶制成。為了防止漏水。水槽和玻璃片相接處必須用石蠟或

7、者指甲油焊封。水槽制作步驟：a.先剪下一段適當(dāng)長的膠條，如圖示粘在玻璃刀上。注意粘好后，膠條的上邊與刀緣形成的平面應(yīng)與刀的底面平行，便于切刀時調(diào)節(jié)。b.借助酒精燈和小鐵片條為工具，用適量的石蠟封住水槽的三個邊緣，以防漏水。刀的檢驗與保護(hù)：明顯的劣質(zhì)刀是出現(xiàn)雙刀根（即無刀緣）、刀緣凸起、刀緣凹陷或刀緣上有明顯的裂損等，這樣的刀不能使用。為了減少切片時的麻煩，有必要在制作水槽之前，先檢查一下刀緣是否有用肉眼看不出來的微小損傷，及時淘汰劣質(zhì)玻璃刀。4、 載網(wǎng) 載網(wǎng)是用來撈超薄切片的，以便繼續(xù)進(jìn)行染色和觀察。市售有多種類型的載網(wǎng)供我們選擇。一般載網(wǎng)的外直徑都是3mm，載網(wǎng)有正反面，光面為正。對于一般普

8、通組織超薄切片，可選用200-300目的載網(wǎng)；對于過小的過碎的樣品，可選用400目的載網(wǎng)；對于不易查找的樣品，可選用帶字母記號的載網(wǎng)，以幫助記憶目標(biāo)的位置。載網(wǎng)有銅、金、鉑金、不銹鋼和鎳制等多種，常用的是銅網(wǎng)和不銹鋼網(wǎng)。在使用之前，新網(wǎng)和舊網(wǎng)都需要清洗，清晰的目的除了使載網(wǎng)潔凈之外，還有除去載網(wǎng)的靜電以便撈片的作用。對于新的載網(wǎng)，直接用95%的乙醇或100%的丙酮浸泡一下，再用重蒸水沖洗后自然晾干即可。清洗舊載網(wǎng)的方法：a. 氯仿法：用氯仿浸泡，把舊網(wǎng)放入錐形瓶中，用氯仿浸泡若干天（經(jīng)?；蝿涌梢詭椭鷼埓娴臉悠窂妮d網(wǎng)上脫落）接著用重蒸水沖洗數(shù)次，再用100%乙醇洗一次后，放到墊有濾紙的培養(yǎng)皿中自

9、然晾干。b. 燃燒法：用乙醇火焰燒灼片刻，取一個小托盤，上面平放一個30ml的小坩堝，倒入95%的乙醇，小心點燃，用舊鑷子夾住一個舊網(wǎng)在火焰的中心部藍(lán)火苗（又稱還原焰）上灼燒片刻，然后直接松開鑷子，讓載網(wǎng)落入小坩堝中。切忌在外層黃火苗中燃燒，因此處溫度高。另外還要注意掌握燒灼的時間，太短不易徹底燒干凈，太長容易使載網(wǎng)過熱變形，以燒灼后載網(wǎng)又重放金屬光澤為宜；燒完之后，用玻璃片蓋住小坩堝口使火焰熄滅。再用重蒸水沖洗載網(wǎng)若干次，最后用100%乙醇洗一次后，撈出放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。c.濃硫酸法：用濃硫酸浸泡 如果有這樣的特殊要求，如做免疫電鏡標(biāo)記時，最好選用化學(xué)惰性較大的金網(wǎng)和鎳網(wǎng)，以減

10、少其它化學(xué)反應(yīng)的干擾和對載網(wǎng)的銹蝕，從而提高樣品的質(zhì)量。5、 支持膜 載網(wǎng)的目數(shù)再高也是有孔隙的，為了防止極微小的樣品在撈片時漏掉；或切片在電子束的轟擊下卷曲；或為了加強(qiáng)空隙大的載網(wǎng)的支持作用等，需要在載網(wǎng)上覆蓋一層支持膜（厚約20nm）。較常用的有：孚爾瓦膜、碳膜、火棉膠膜等。1> 孚爾瓦膜-一般制成20nm左右，它的支持力較強(qiáng)，但制備較復(fù)雜。2> 碳膜-分辨率高，只需幾個納米厚，化學(xué)性能穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度也較高，常用于加固其它膜（制備時需要用到真空噴鍍儀）。3> 火棉膠膜-機(jī)械強(qiáng)度小，但容易制備，較為常用。三、超薄切片的步驟 1、修塊 2、安裝包埋塊3、安裝玻璃刀4、調(diào)節(jié)刀與

11、組織塊的距離與角度（對刀）5、調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置6、調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片7、將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上1、修塊在進(jìn)行超薄切片前，首先必須對包埋塊進(jìn)行修整。目的是使包埋塊中組織暴露出來。首先依樣品的位置，將包埋塊頂端削平，露出組織，然后再削去周圍的包埋劑及無關(guān)的部分，把要觀察的部分修成錐體，（但注意不要把錐體修得過于突出，否則在切片的過程中容易產(chǎn)生振紋），并將頂端的平面修成邊界明顯的平整的梯形（或方形）。2、安裝包埋塊把修整好的包埋塊固定在定向頭上，然后鎖住樣品桿，把定向頭固定在樣品桿上。固定時，必須使組織切面的底邊成水平放置，若是修成梯形的切面要讓長邊在下方。此外，支持器夾著包

12、埋塊的位置應(yīng)盡可能靠近樣品面。3、安裝玻璃刀把裝有水槽的刀插入到刀夾并固定。此外，刀邊應(yīng)緊靠著刀夾的邊緣，刀刃應(yīng)與刀臺上的標(biāo)志桿等高，并根據(jù)組織塊軟硬程度不同，調(diào)節(jié)切割角度（是實際刀角和刀角隙角之和），當(dāng)?shù)督且呀?jīng)確定時，只能調(diào)節(jié)刀的間隙角，通常為4-5°，如果是鉆石刀可根據(jù)說明書中推薦的刀角來選擇（一般為6°左右）。4、對刀對刀是超薄切片過程中極為重要而又較難掌握的一環(huán)。對刀時，操作者必須十分仔細(xì)。否則，將無法切出切片。對刀的步驟：鎖定樣品桿和裝刀后，先調(diào)整顯微鏡的位置及刀的位置，使其能看清刀刃以及能看到樣品塊的位置，調(diào)整樣品面的位置讓切面的兩個平行邊與刀刃平行。然后選擇好

13、的刀刃段，用粗調(diào)進(jìn)刀，直至在組織塊的表面觀察到影子（反射像）時，仔細(xì)觀察影子，并調(diào)整刀刃與樣品面的角度，使刀刃與樣品面完全平行（此時影子是平行的切上下移動樣品塊時影子經(jīng)過樣品面的范圍和粗細(xì)是不變的），最后用細(xì)調(diào)進(jìn)刀，使影子呈一條幾乎覺察不出來的狹縫為止。此時，若使樣品面在刀刃上下運動，則可看到刀刃剛剛接觸到樣品面。5、調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置對完刀后，即可向水槽內(nèi)注入雙蒸水或15%乙醇溶液。開始可注入過量的液體并使液面成凸面，以保持浸濕刀刃。然后，在顯微鏡下吸回一些液體，當(dāng)液面出現(xiàn)一反射光的亮面為止。這個亮面不僅可以體現(xiàn)所需的水面，而且通過它還可以觀察切片的質(zhì)量及估計切片的厚度。如果刀刃浸濕

14、和亮面無法同時滿足時，可以在保持刀刃浸濕的最低水面的情況下嘗試調(diào)整燈的角度。注意當(dāng)水面過高時，切片很難連接成帶，而且樣品面和刀背容易沾濕。6、調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片加水后，即可打開自動切片開關(guān)進(jìn)行切片。切片開始后，切片可稍厚一些（約80-90nm），然后可根據(jù)切片的情況調(diào)節(jié)切片速度和厚度，直至切出滿意的切片。切片機(jī)上雖然有切片厚度指示標(biāo)志，但并非代表切片的實際數(shù)值，可以結(jié)合切片在水面上的干涉色來粗略估計切片的厚度。這種顏色是由切片頂面反射的光波和與切片與水的界面反射的光波之間的干涉所產(chǎn)生的。切片過厚，實際上不能用于電鏡觀察。要獲得較好的圖象，一般需要銀白色到淡黃色的切片。切片厚度與顏色：

15、<50nm 灰色60-90nm 銀灰色90-150nm 金黃色150-190nm 紫色190-240nm 藍(lán)色240-280nm 綠色（1）切片的方法：超薄切片實際上是發(fā)生在樹脂表面的修削動作。切片的技術(shù)性較強(qiáng)，要反復(fù)實踐才能操作自如。常用的超薄切片機(jī)有多種類型，性能和外觀上有一些區(qū)別，但一般都是熱脹式的。（2）切片的程序：a.接通電源，開機(jī)（此時應(yīng)聽到蜂鳴音，說明線路接通）。b.送一下樣品臂再鎖定，蜂鳴音止住。打開照明燈（檢查刀緣時用白熾燈，切片照明時用熒光燈）。c.安放樣品（注意擺正和夾牢）。d.安放刀并夾牢，用玻璃刀時要使刀緣、樣品頭和標(biāo)尺在一個水平面上，選擇刀角（一般2-6

16、76;）。e.用體視顯微鏡觀察對刀，搬動燈架調(diào)節(jié)熒光燈的角度，使樣品和刀緣處明亮。接著調(diào)節(jié)刀座的方向，使刀緣和樣品的下邊緣平行。再緩緩移動刀座，使刀鋒的右邊靠近樣品頭。先用粗調(diào)節(jié)鈕順時針旋轉(zhuǎn)進(jìn)刀（每轉(zhuǎn)一周，刀臺向進(jìn)刀方向移動0.5mm，其調(diào)節(jié)范圍大約10mm），當(dāng)樣品頭平面上顯示出刀緣的暗影時，說明二者之間的距離已很近。再用細(xì)調(diào)節(jié)鈕順時針方向旋轉(zhuǎn)進(jìn)刀（每轉(zhuǎn)一格，刀臺向進(jìn)刀方向移動1/jm），直到樣品頭與刀鋒之間僅有一絲間隙。f.繼續(xù)用細(xì)調(diào)節(jié)鈕順時針轉(zhuǎn)動進(jìn)刀，每次2-4格為宜，同時用手動試刀，邊進(jìn)刀邊切，直到切下完整的切片為止（注意進(jìn)刀要緩慢，防止把樣品頭整個切掉）。g.松開樣品臂，用注射器向水

17、槽中緩慢注入重蒸水，調(diào)節(jié)水面與刀緣平行，同時邊調(diào)節(jié)邊移動熒光燈的角度，使水面干涉光呈乳白色。h.將刀座平行移動，使刀緣左邊1/3處最鋒利的部分對準(zhǔn)樣品。轉(zhuǎn)到自動切片，選擇適當(dāng)切速（一般2或5mm/s），調(diào)節(jié)切片厚度,并通過顯微鏡觀察切片的情況，判斷切片的厚度，隨時應(yīng)變處理。i.切除足夠的切片后，關(guān)閉自動切片，用鑷子夾住載網(wǎng)，有支持膜的那面朝下，并使其平面與水槽平面平行，輕輕沾起切片，再用一小片濾紙吸去鑷子上多余的水，然后輕輕放入樣品盒自然晾干。k.撈完切片之后，在換樣品的同時，打開電吹風(fēng)冷卻片刻，以保持切片機(jī)有良好的持續(xù)切片性能。全部完成切片工作后，一定要鎖柱樣品臂，取下樣品夾頭，擦干凈臺面，

18、并關(guān)閉所有的電源。（3）切片中可能出現(xiàn)的問題和解決的辦法：1> 產(chǎn)生問題的原因：切片的質(zhì)量往往受諸多因素的影響，切片中很可能會出現(xiàn)各種各樣的問題，特別是有關(guān)切片質(zhì)量的問題。如切片開裂、切片過厚（表面的干涉光五顏六色）、切片上有一行行的平行排列的條紋或縱行的劃痕、切片不能連續(xù)成串等。 a.影響包埋塊質(zhì)量的因素-包埋劑是否混合均勻、聚合的條件是否合適、樣品滲透是否充分等。 b.切片準(zhǔn)備工作方面的因素-修塊是否規(guī)范、刀口是否鋒利、水槽的制作是否規(guī)范等。c.切片過程中的某些因素-刀角的選擇（過大或過?。⒌逗蜆悠返陌惭b（是否牢固和標(biāo)準(zhǔn)）、切速的選擇（過快或過慢）、對刀是否規(guī)范等。d.其它方面的因

19、素-附近是否有大型機(jī)械振動源、電壓是否穩(wěn)定、室溫是夠否過高或過低等。 2> 可能出現(xiàn)的問題和相應(yīng)的措施： a.切片上有顫紋-這是切片中常出現(xiàn)的問題之一，其表現(xiàn)為切片上布滿平行于刀緣的條紋，或粗或細(xì)，疏密不一，這是在切片過程中有震顫引起的。b.切片破碎-切片破碎是不宜撈取的，不完整的片子電鏡觀察時往往也得不到良好的圖像。c.切片不能連成帶-有的研究工作需要連續(xù)要觀察連續(xù)切片，如果切下的片都一個個散開，就無法撈片。d.切片厚薄不均-同一張切片有厚有薄的表現(xiàn)是切片的干涉色不一致，即有深有淺或五顏六色，這將直接影響成像的質(zhì)量。e.其他- 切片帶水：指樣品塊頭部有水和刀背上沾水，使無法正常切片。解

20、決的辦法就是用干凈的濾紙條吸掉，但要注意操作時切勿碰刀鋒。如果是水槽液面太高引起的，就需重新調(diào)整一下液面。 空切：切片時只有樣品臂上下運動，卻不見有片下來的情況被稱為空切。引起空切的原因可能是對刀不準(zhǔn)確、距離樣品太遠(yuǎn)或樣品面與刀緣不平行。也可能是加熱不足或加速過快等。F.水面干涉色消失-有時在切片過程中，本來已調(diào)好的乳白的干涉色水面會緩緩消失，變成一片片黑影，使無法觀察切片。其原因是水槽液面下降了，這可能是由于切片過程太長，水分揮發(fā)和連續(xù)撈片損失引起的；也可能是由于水槽沒封牢漏水引起的，應(yīng)及時檢查原因，對癥解決。 四、電子染色電子染色-是用重金屬鹽溶液處理樣品，使其與細(xì)胞中某些特定的成分結(jié)合或

21、使其吸附在某些特定的結(jié)構(gòu)上。染色時要掌握染夜的濃度、pH和染色時間等必要條件，使染色的同時不會掩蓋精細(xì)結(jié)構(gòu)的層次。這種經(jīng)過電子染色的樣品，在電子束的轟擊下，樣品中不同的部位，就會產(chǎn)生不同的散射電子量。在吸附重金屬染色劑的區(qū)域，由于其電子的含量高，散射電子的量亦高，在熒光屏上就呈現(xiàn)為暗區(qū)。樣品中不同的成分與電子染色劑相結(jié)合或相吸附的能力是有差異的，這就使熒光屏上成像的明暗和深淺不一致，顯示出層次和反差良好的圖像來了。（1）目前已有多種重金屬鹽類被用來進(jìn)行電子染色，如鈾、鉛、餓、猛、鐵、鐐、鎢、鑭等重金屬鹽類。常用的重金屬染色劑-鈾鹽和鉛鹽。 a.鈾鹽-常用醋酸雙氧鈾制電子染色劑，其為熒光色粉末，

22、能發(fā)射熒光，有微量放射性，所以使用時應(yīng)格外小心，不要污染皮膚和實驗臺面。其在15的溶液濃度是7.7%，用50%或70%乙醇支配可提高溶解度。 染色時要避免強(qiáng)光照射，并且最好用棕色瓶子避光保存染液，以減少光化學(xué)作用，防止染液變質(zhì)。如果染液渾濁了或顏色變深了，說明已經(jīng)變質(zhì)，應(yīng)棄之。它的染色原理是通過雙氧鈾離子與樣品中的生物分子基團(tuán)相結(jié)合而實現(xiàn)的。 染色方法：在蠟盤上點滴染液，每滴染液上放一個有切片的載網(wǎng)（注意有切片的一面朝下），加蓋防塵，必要時再罩一個硬紙殼盒避光。一般在室溫條件下染20-60分鐘。染好后用重蒸水徹底清洗，具體方法是用鑷子夾住樣品，再用一小片濾紙吸去載網(wǎng)上多余的染液（注意接觸載網(wǎng)邊

23、緣吸取，切勿碰樣品表面）。用2-3個小燒杯盛滿重蒸水，依次排開，使夾住的樣品在垂直方向上緩緩抖動（注意每次抖動時不要沖出液面，以防表面張力引起的沖勁使樣品脫落）。依次洗過之后，可再用吸管沖洗一下， b.鉛鹽-常用檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛）配制電子染色劑。鉛鹽有毒，并且容易與空氣中的二氧化碳反應(yīng)形成碳酸鉛沉淀而污染樣品。所以配制和使用時要格外小心。其染色過程其實是一種離子結(jié)合反應(yīng)，即鉛離子與活性基團(tuán)的反應(yīng)。鉛染色的效果受多種因素的影響，如固定劑的種類、染色液的pH和所染樣品的成分等。染色方法：與鈾染相似，也用小液滴染色法。為了防止二氧化碳與染液反應(yīng)產(chǎn)生碳酸鉛沉淀而污染樣品，需在液滴的周圍擺一些氫氧化鈉

24、顆粒，用以吸附空氣中的二氧化碳。染色時也要加蓋防護(hù)。另外操作時盡量避免直接對著正在染色的樣品吹氣，清洗時的操作要快。還可以把樣品立即放入0.1m01/L的氫氧化鈉溶液中漂洗1-2s，出去樣品上多余的染液，再如前依次用重蒸水沖洗，能更有效的防止污染。 四、造成超薄切片發(fā)生缺陷的因素：在一定的設(shè)備條件下，一個已經(jīng)進(jìn)行了改良的固定、包埋和滲透以及聚合的樣品塊，在進(jìn)行超薄切片制備過程中還有許多因素可造成超薄切片的困難。其中包括切割過程本身的物理過程、環(huán)境的參數(shù)，空氣的流動、濕度等周圍的環(huán)境以及超薄切片和刀刃的物理條件，樣品和樹脂的種類和性質(zhì)等環(huán)境因素只要是能引起振動的所有因素，包括機(jī)械泵、冰箱、空調(diào)、

25、空氣抽濕機(jī)以及周圍交通、人員的走動或者操作者與切片機(jī)有太多的接觸等引起的各種地面及空氣的振動，都會引起切片的缺陷。其它的環(huán)境因素還包括空氣的濕度、溫度的變化等。過渡的熱量能引起超薄切片機(jī)的一些金屬部件發(fā)生差動熱漂流，從而引起切片厚度差異。而非常低的濕度可引起靜電荷，堆積在包埋塊的表面或刀刃上，可阻止切片被切割。在切片過程中靜電荷還能產(chǎn)生許多問題，雖然它在切片上不引起常見的可見的缺陷，但在切割和收集切片上產(chǎn)生很大的困難。（1） 顫痕 顫痕是切片厚度的有規(guī)律的變化（厚薄交替變化）。在一些切片上，顫痕可見于整個切片，而有些只局限于某一區(qū)域。后一種情況可能是樣品組分的不同的一種反應(yīng)（主要是硬度不同），

26、這種局部的厚度差異在脂滴和植物細(xì)胞的液泡中比較常見。顫痕總是平行于切片的底邊，即總平行于刀刃。顫痕產(chǎn)生的原因：刀和樣品相互作用是產(chǎn)生的高速振動，需仔細(xì)檢查各部件和樣品的固定情況，就可改善。外部有振動源，移動振動源即可減少顫痕。切割速度、玻璃刀刀角以及樣品的大小的不恰當(dāng)選擇也可以引起顫痕。對于硬度過高的包埋塊，刀角的減小可以適當(dāng)減少顫痕的出現(xiàn)頻率，對于軟的包埋塊，可以選擇大的刀角更合適。一般來說小的樣品表面對刀和包埋塊的壓強(qiáng)也小，這樣形成顫痕的可能性也相對小。對較硬的樹脂和難切的樣品如植物、昆蟲和骨組織，樹脂塊的表面修理锝小一點特別重要。形成顫痕的另一個比較重要的來源是樣品塊在修理時樣品塊切面太

27、突兀，形成了細(xì)細(xì)的一條，高出支持樹脂塊；夾樣品的夾頭在固定樣品時角度的不合適，這樣導(dǎo)致樣品表面與支持點太遠(yuǎn)。這些都可以導(dǎo)致顫痕的出現(xiàn)。一般在修理包埋塊時，斜面的角度不要大于50°，以便給切割面提供合適的支持力，樣品固定在夾頭時也要保持最緊的支持點靠近樣品切割面。此外，若樣品塊太軟或太硬、或聚合不完全都可能導(dǎo)致顫痕的產(chǎn)生。遇到這種情況時只能更換樣品樹脂包埋塊。（2） 皺縮 皺縮是指樣品表面的長度比切下來的切片長，在電鏡下觀察圖像結(jié)構(gòu)顯示定向的改變或波線或者部分切片中平行切割邊.的波動和皺紋。皺縮的形成與樹脂的種類和硬度，樣品的種類、刀角、切割速度等有關(guān)。較軟的樹脂容易產(chǎn)生皺縮，植物材料比動物材料容易產(chǎn)生皺縮，特備是樣品的軟部分具有不同周圍樹脂硬度的組分時，皺縮就肯定發(fā)生在樣品較軟的部位。皺縮一般也平行于刀刃。樣品塊表面修理的足夠小，調(diào)整刀角度，改變樹脂硬度，切割