動(dòng)物抗血清及其制備技術(shù)要點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)展

1、動(dòng)物抗血清及其制備技術(shù)要點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)展抗血清對(duì)于控制動(dòng)物疫病具有很重要的作用。本文綜述了動(dòng)物抗血清的發(fā)展歷程，產(chǎn)品技術(shù)現(xiàn)狀、制備技術(shù)要點(diǎn)與最新研究應(yīng)用進(jìn)展以及面臨的問題等方面。作為動(dòng)物疫病預(yù)防控制的有力武器，獸用生物制品在畜牧業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用。而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，獸用生物制品也發(fā)生了翻天覆地的變化，新技術(shù)、新方法的不斷出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用，為我國(guó)獸用生物制品的發(fā)展進(jìn)步提供了強(qiáng)大的助力。獸用生物制品可以分為以下四類：預(yù)防用生物制品;治療用生物制品;診斷檢測(cè)用生物制品;免疫調(diào)節(jié)類生物制品。其中，治療用生物制品包括抗血清、高免蛋黃抗體、免疫球蛋白及干擾素等。各種生物制品的種類比較多，但

2、是有些產(chǎn)品的質(zhì)量卻不是很高，有待于進(jìn)一步改進(jìn)。本文就治療用生物制品中的抗血清及其在最近幾年的研究應(yīng)用進(jìn)展做一綜述?？寡逵址Q高免血清或抗病血清，是一種含有高效價(jià)特異性抗體的動(dòng)物血清?？寡灏苟舅?、抗細(xì)菌、抗病毒血清?？苟舅匮澹河眉?xì)菌類毒素或毒素免疫異源動(dòng)物所取得的血清， 如破傷風(fēng)抗毒素;抗菌血清：用細(xì)菌免疫異源動(dòng)物所取得的血清，如抗炭疽血清;抗病毒血清：用病毒免疫異源動(dòng)物所取得的血清，如抗豬瘟血清。1 抗血清的發(fā)展歷程兩個(gè)世紀(jì)前，人們將白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)上清中分離到的可溶性毒素注入馬體內(nèi)，得到的抗血清可以治療白喉，這是第一個(gè)用抗體治療的例子。經(jīng)過兩百多年的發(fā)展，人們已經(jīng)可以通過各種免疫手段來獲

3、得針對(duì)毒素、病毒、細(xì)菌乃至癌細(xì)胞的特異性抗體。在我國(guó)，抗血清的研究利用也比較早。上世紀(jì)初，當(dāng)時(shí)的中華民國(guó)籌建第一個(gè)血清所青島商品檢驗(yàn)局血清所，一直到抗日戰(zhàn)爭(zhēng)的先后20年中，研究和生產(chǎn)了多種獸用抗血清，有：牛瘟抗血清、豬瘟抗血清、豬肺疫抗血清、牛出敗抗血清、禽霍亂抗血清、豬丹毒抗血清等1。建國(guó)后，經(jīng)過近60年的發(fā)展，抗血清的研究和應(yīng)用也已經(jīng)相當(dāng)成熟。目前，對(duì)血清抗體的研究已進(jìn)入新的發(fā)展階段，即免疫球蛋白的研究和應(yīng)用。2 產(chǎn)品及技術(shù)現(xiàn)狀據(jù)新版的中華人民共和國(guó)獸藥典(以下簡(jiǎn)稱“獸藥典”)可知，國(guó)家已經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)應(yīng)用的抗血清有：抗氣腫疽血清、抗炭疽血清、抗綿羊痢疾血清、抗豬羊多殺性巴氏桿菌病血清、抗豬瘟

4、血清、破傷風(fēng)抗毒素、抗豬丹毒血清等，以及抗犬瘟熱血清、抗細(xì)小病毒病血清等“非獸藥典”產(chǎn)品2。與抗血清相并列的高免卵黃抗體也比較成熟，現(xiàn)在市場(chǎng)上的產(chǎn)品有小鵝瘟精制蛋黃抗體、鴨病毒性肝炎精制蛋黃抗體、雞傳染性法氏囊病精制蛋黃抗體，其中前兩種在藥典中已有詳細(xì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。而針對(duì)于動(dòng)物疫病的免疫球蛋白，在市場(chǎng)上還沒有相關(guān)的產(chǎn)品。而國(guó)外抗體方面的研究和應(yīng)用要較國(guó)內(nèi)還要早，且已經(jīng)上市的產(chǎn)品比國(guó)內(nèi)的產(chǎn)品更多更全面3。相對(duì)于人的治療性的抗體產(chǎn)品，動(dòng)物的抗血清產(chǎn)品也顯得相對(duì)不足。雖然抗體產(chǎn)品比較少，但專利技術(shù)卻比較多。經(jīng)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利查詢網(wǎng)站查實(shí)，到目前為止，已經(jīng)公布的動(dòng)物性抗血清的專利技術(shù)已有20余種，卵黃

5、抗體的專利技術(shù)40多種，而免疫球蛋白的專利技術(shù)也近20種。而查詢美國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的網(wǎng)站得知，近10年美國(guó)在抗血清相關(guān)方面的專利有10多項(xiàng)。3 制備要點(diǎn)及相關(guān)技術(shù)的研究進(jìn)展談到抗血清，無論是在科學(xué)研究中還是在應(yīng)用實(shí)踐中，它都起著很大的作用。如在研究中，可用作標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清;在臨床應(yīng)用中，則是一種很好的治療性抗體?？寡宓闹苽浼夹g(shù)雖說目前比較成熟，但是還會(huì)在不同層面上出現(xiàn)各種各樣的問題。結(jié)合前人的研究成果，依托本項(xiàng)目組的相關(guān)研究課題，總結(jié)了一套抗血清制備技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)，并對(duì)最近幾年相關(guān)的研究應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行概述。3.1 抗血清的作用及其制備理論特異性抗血清可提供相應(yīng)疫病短期(12周)的被動(dòng)免疫，效果確實(shí)，廣

6、泛使用于疫病早期治療和疫病流行早期與未感染動(dòng)物的短期預(yù)防，也可抑制引起器官移植死亡的淋巴細(xì)胞活動(dòng)，特異性抗血清還可用于疾病診斷與微生物鑒定。但存在劑量要求大，保護(hù)期短，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，而且需在隔離條件下進(jìn)行，以防散毒。通常對(duì)緊急預(yù)防的動(dòng)物，仍需進(jìn)行常規(guī)的免疫接種4?？寡寮瓤梢岳貌≡⑸锟乖庖咄N或異種動(dòng)物后采血提取血清制備,也可以提取耐過的自然感染動(dòng)物血清制造。通常是給動(dòng)物適當(dāng)反復(fù)多次注射特定的病原微生物或其代謝產(chǎn)物等物質(zhì)(抗原、免疫原)，促使動(dòng)物不斷產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)(體液免疫與細(xì)胞免疫)，從而使血清中含有大量相應(yīng)的特異性抗體，然后采(放)血、分離血清制成。具體的制備過程，各種疾病略有

7、不同，且已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道511。下面將著重對(duì)作者制備抗血清過程的各個(gè)環(huán)節(jié)中總結(jié)的一些經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行闡述。3.2 抗血清的制備技術(shù)要點(diǎn)及研究進(jìn)展 動(dòng)物的選擇抗血清制備的第一步，也是比較關(guān)鍵的一步是免疫動(dòng)物的選擇?？勺鳛槊庖哂玫膭?dòng)物多為哺乳類和禽類，主要有家兔、綿羊、馬、牛、豬、驢、豚鼠和雞等，其中實(shí)驗(yàn)常用家兔、綿羊、雞和豚鼠。張振興12總結(jié)出，大批抗血清是多用馬、牛生產(chǎn)的，因?yàn)橐话闱闆r下馬、牛具有產(chǎn)量大、成本低、飼養(yǎng)管理方便等優(yōu)點(diǎn)，在高免中具有不受接種途徑、接種量與接種次數(shù)的限制。而且最好選擇年齡38歲(或310周歲的閹牛)經(jīng)檢疫健壯的馬、牛進(jìn)行，且能經(jīng)采血后繼續(xù)高免循環(huán)利用。根據(jù)報(bào)道的研究文獻(xiàn)，結(jié)

8、合對(duì)抗血清制備研究的經(jīng)驗(yàn)，在選擇動(dòng)物時(shí)要注意以下幾個(gè)方面：抗原與動(dòng)物種系的關(guān)系：動(dòng)物性抗原的免疫原性，隨動(dòng)物種系遠(yuǎn)近而有差別。近緣動(dòng)物的蛋白質(zhì)免疫原性弱，反之則強(qiáng)。因此選擇動(dòng)物時(shí)應(yīng)選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物。抗血清的用量：根據(jù)所需要免疫血清的量，來選擇免疫動(dòng)物。如是經(jīng)常大量使用，選擇免疫動(dòng)物時(shí)則應(yīng)選擇大動(dòng)物;若所需的免疫血清量不大，則以選擇小動(dòng)物為宜。動(dòng)物的個(gè)體狀態(tài)：用于免疫的動(dòng)物必須是適齡、健壯、無感染的動(dòng)物。免疫過程中應(yīng)特別注意營(yíng)養(yǎng)和衛(wèi)生管理。注射抗原1個(gè)月后，動(dòng)物仍無良好的抗體反應(yīng)，或在規(guī)定注射日程后抗體效價(jià)不高，可再注射l2次，若仍不佳者立即淘汰。 免疫原制備事實(shí)說明，選擇具有良好的反應(yīng)原

9、性和免疫原性的抗原，是作為制備優(yōu)質(zhì)抗血清的基礎(chǔ);而制備優(yōu)良抗原的關(guān)健是選擇優(yōu)良的菌(毒)株，所以應(yīng)挑選形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性、血清學(xué)與抗原性、毒力等具有典型性的菌(毒)株作為抗原制造用毒株。張振興等13在其文章中指出，抗原制備方法隨免疫途徑、程序、毒株的特性而異。而按照病原性區(qū)分，可分為兩類，一類是病毒性抗血清，一般是用本動(dòng)物的含毒組織(發(fā)病雞胚或病變細(xì)胞)作抗原，首先把強(qiáng)毒接種本動(dòng)物(雞胚或細(xì)胞)，使其發(fā)病(或病變)，采取其含毒性組織(發(fā)病雞胚或病變細(xì)胞)作為抗原，注射于免疫動(dòng)物。另一類是細(xì)菌性血清，是用抗原性好的強(qiáng)毒或弱毒菌種，接種于規(guī)定培養(yǎng)基內(nèi)，于37培養(yǎng)，細(xì)菌發(fā)育良好者，經(jīng)純粹檢驗(yàn)后用作

10、抗原。 免疫接種據(jù)報(bào)道1418，由于病原體的特點(diǎn)、免疫機(jī)理等不同，其制備抗血清的免疫方案也不盡相同，即使是同一疫病，也有不同的免疫方案;而且用不同的免疫方案制備的抗血清，其效價(jià)亦有差異。因此，為了獲得高效價(jià)的免疫抗體，動(dòng)物的免疫程序一般分為基礎(chǔ)免疫與高度免疫?；A(chǔ)免疫一般是注射疫苗，然后再以遞增量強(qiáng)毒抗原進(jìn)行高免;或者用佐劑抗原進(jìn)行連續(xù)免疫。每次注射劑量，要隨著注射次數(shù)的增加而增加。接種抗原的次數(shù)和劑量，應(yīng)根據(jù)制造抗血清的品種和動(dòng)物健康情況加以調(diào)整。為了獲得效價(jià)高的抗血清，動(dòng)物飼養(yǎng)條件必須保持良好。免疫劑量、次數(shù)、間隔，在各種抗血清制造中差異極大，如抗豬丹毒血清全程要注射抗原20次，歷時(shí)601

11、00 d;抗豬瘟血清要注射6次以上，全程約50 d，且以獲得高抗體效價(jià)為佳。 血清抗體的檢測(cè)免疫程序接近結(jié)束時(shí)，測(cè)定血清的抗體效價(jià)，如果效價(jià)已達(dá)規(guī)定的要求，即可視作免疫成功，開始采血。若經(jīng)試血，血清效價(jià)不合格，則可繼續(xù)增加注射抗原次數(shù)或劑量，如再試血仍不合格，應(yīng)將動(dòng)物淘汰。測(cè)定免疫血清效價(jià)是及時(shí)掌握采血時(shí)機(jī)的重要步驟。在“獸藥典”中規(guī)定了各種血清抗體的檢測(cè)方法。目前，關(guān)于抗體效價(jià)不同檢測(cè)方法的報(bào)道也很多，有血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)19，20、間接ELISA試驗(yàn)21，22、斑點(diǎn)ELISA試驗(yàn)23、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)24，25等。如果用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定血清效價(jià)時(shí)，若在抗原孔與抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線者，即為陽(yáng)

12、性。最高稀釋倍數(shù)血清孔出現(xiàn)沉淀線，即為該血清的抗體效價(jià)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的效價(jià)通常比環(huán)狀沉淀反應(yīng)稍低。 血清采集與提取經(jīng)驗(yàn)得出，通常在末次免疫后710 d采血樣檢測(cè)抗體效價(jià)，抗體滴度達(dá)到要求后再按體重采血(10 mL/kg)。不論免疫動(dòng)物是大動(dòng)物或小動(dòng)物，采血方法均分一次放血和多次放血法兩種：一次放血：綿羊或其他大動(dòng)物可用頸動(dòng)脈放血，家兔、豚鼠和雞等小動(dòng)物則可通過心臟直接采血;多次少量放血法：大動(dòng)物可通過靜脈采血，小動(dòng)物可通過心臟采血，在第1次采血后35 d可進(jìn)行第2次采血，經(jīng)35 d后進(jìn)行第2個(gè)免疫程序。注意，動(dòng)物采血應(yīng)在上午空腹時(shí)進(jìn)行，提前禁食1d，可避免血中出現(xiàn)乳糜而獲得澄清的血清。血清提取

13、常采用自然凝固加壓法和枸櫞酸鹽血漿分離血清法。在操作過程中，應(yīng)該注意的是，血清的分離應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，并應(yīng)盡量防止溶血。采血用的器械、容器等用前要進(jìn)行滅菌，以無菌操作采血，分離的血清加防腐劑經(jīng)檢驗(yàn)合格后分裝，保存。3.3 抗血清的檢驗(yàn)按照中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(以下簡(jiǎn)稱“質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”)的要求，每一種生物制品都需要進(jìn)行檢驗(yàn)26。抗血清的檢驗(yàn)包括物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)和苯酚或汞類防腐劑殘留量測(cè)定。物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)均按“質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”中成品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。其中，外源病毒檢驗(yàn)時(shí)檢查的病毒有：禽類：雞傳染性支氣管炎

14、病毒、雞新城疫病毒、禽腺病毒、禽A型流感病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、雞馬立克氏病病毒、禽淋巴白血病病毒、禽腦脊髓炎病毒、雞痘病毒;家畜：牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、藍(lán)舌病病毒、馬傳染性貧血病毒、狂犬病病毒。安全檢驗(yàn)通常用體重1822g的健康小白鼠5只，各皮下注射血清0.5ml，用體重250450g的健康豚鼠2只，各皮下注射血清10ml，觀察10天，均應(yīng)健活。效力檢驗(yàn)則按不同病原的抗血清規(guī)定方法和劑量進(jìn)行。苯酚或汞類防腐劑殘留量測(cè)定應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。4 抗血清中病原體的處理對(duì)于新制備的抗血

15、清，如果沒有對(duì)外源病原體的檢測(cè)和相應(yīng)的處理，則其應(yīng)該是一種不合格的產(chǎn)品。因此，處理抗血清中的病原體(主要是病毒)成為抗血清安全性的首要問題，也是提高抗血清產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一般情況下，處理病毒需進(jìn)行以下三個(gè)方面的程序：病毒排除、病毒去除和病毒滅活。排除病毒的最主要的工作是對(duì)材料的篩選，它至少防止了抗血清分離混合物中過高的病毒負(fù)荷27。而去除病毒則是確?？寡宄善钒踩囊粋€(gè)重要程序。其去除過程主要依據(jù)的是傳統(tǒng)物理法，如膜過濾法等。膜過濾法去除病毒的原理是利用病毒顆粒體積大于膜平均孔徑而使病毒載留在濾膜上。通過這一步，可使抗血清制品得到進(jìn)一步純化28。最具有技術(shù)難度的是病毒滅活技術(shù)。因?yàn)樗x

16、的滅活方法必須滿足以下條件：滅活技術(shù)本身或其致活因子與血液成分反應(yīng)的產(chǎn)物應(yīng)無急、慢性毒性作用;不使血清成分發(fā)生變性，不產(chǎn)生新的免疫原，或不使長(zhǎng)期使用者發(fā)生免疫反應(yīng)性疾病;滅活后的終產(chǎn)品仍然具有正常理化活性和免疫學(xué)性質(zhì);滅活方法要簡(jiǎn)便、可行，無需大量人力、設(shè)備和空間29。目前，已經(jīng)開發(fā)利用的方法很多，但只有其中一些比較適合抗血清制品的病毒滅活，如亞甲藍(lán)/光化學(xué)(MB)法30、-射線輻照法31，32、以核酸為靶點(diǎn)的光化學(xué)技術(shù)33，34以及流體力學(xué)高壓法35等。5 抗血清的應(yīng)用幾乎所有動(dòng)物傳染病的病原微生物(特別是細(xì)菌和病毒)及其代謝產(chǎn)物都可制造相應(yīng)的抗血清，用于疾病的緊急預(yù)防與治療，部分高免血清可

17、以用于疾病診斷和病原鑒定，這在我國(guó)目前的國(guó)情下仍具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。特別是針對(duì)于寵物、珍稀動(dòng)物以及易患突發(fā)性疾病的動(dòng)物具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。首先，在疾病的緊急預(yù)防與治療方面的作用就非常突出。目前，市場(chǎng)上的疫苗和治療藥物都有各自的缺點(diǎn)，如疫苗的免疫力保護(hù)力不高，治療藥物易產(chǎn)生耐藥性等等。與疫苗和治療藥物相比，抗血清具有其無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)動(dòng)物接種相應(yīng)抗血清后，機(jī)體迅速得到大量非自身免疫抗體，從而快速中和了侵入機(jī)體的病原，或者抵御了致病病原的攻擊，如抗豬瘟血清有效的控制了豬瘟的疫情，抗犬瘟熱血清對(duì)犬瘟熱有獨(dú)特的療效。當(dāng)前，被批準(zhǔn)的產(chǎn)品還有：抗氣腫疽血清、抗炭疽血清、抗綿羊痢疾血清、抗豬羊多殺性巴

18、氏桿菌病血清、破傷風(fēng)抗毒素、抗豬丹毒血清等2。在疾病診斷和病原鑒定方面，主要體現(xiàn)在作為陽(yáng)性血清上。發(fā)展到現(xiàn)在，盡管有新的疾病診斷和病原鑒定方法不斷出現(xiàn)，但是血清學(xué)診斷方法仍占主要地位。而在用血清學(xué)方法時(shí)，必須要用到陽(yáng)性血清作為反應(yīng)的診斷物。因此，具有高效價(jià)特性的抗血清成為首選。目前，已批準(zhǔn)生產(chǎn)的有：炭疽沉降素血清、布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清、衣原體病間接血凝試驗(yàn)陽(yáng)性血清、口蹄疫細(xì)胞中和試驗(yàn)性血清、藍(lán)舌病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽(yáng)性血清、日本吸血蟲病凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清等38種2。6 抗血清研究及應(yīng)用中的問題及解決方案首先是抗血清產(chǎn)品的安全性問題。要使一種抗血清成為合格產(chǎn)品面市，必須保證制備的抗血清安全，無外源病原。如何清除抗血清中的外源病原則是目前抗血清研究應(yīng)用中面臨的一個(gè)難題，這就需要各種病毒處理技術(shù)去解決。病毒處理技術(shù)已經(jīng)在上面介紹過。但是，還需要發(fā)展更有效的處理技術(shù)。其次是抗血清抗體效價(jià)降低的問題。血清抗體效價(jià)在很多情況下都會(huì)降低，如血清處理、保存血清的溫度、期限等等。在處理血清過程中，如外源病原處理時(shí)，難免會(huì)影響血清抗體效價(jià)，因此，一種有效且不造成抗體效價(jià)改變的病原處理方法將是以后的研究的一個(gè)方向。再就是抗血清本身具有的缺點(diǎn)，如用量大、成本高、質(zhì)量低等。鑒于此，提高抗體表達(dá)量，降低生產(chǎn)成本以及提高產(chǎn)品質(zhì)量等問題將成為以后解決的重點(diǎn)。7