測定靜脈注射人免疫球蛋白IgG含量的三種方法比較

1、測定靜脈注射人免疫球蛋白 IgG 含量的三種方法比較 王 淼 , 薛巧如 , 姚敏菲 , 謝正福 摘 要 目的 對檢測靜脈注射人免疫球蛋白中 I gG 含量的 3種方法進行比較 。 方法 采用紫外分光光度法 、 酶聯(lián) 免疫法 、 高效親和色譜法對靜脈注射人免疫球蛋白進行 I gG 含量測定 。 結果 紫外分光光度法與高效親和色譜法及酶聯(lián)免疫 法之間有顯著性差異 , 高效親和色譜法與酶聯(lián)免疫法之間無顯著性差異 , 高效親和色譜法的重復性較好 , RS D 為 0. 8%。 結論 為選定靜脈注射人免疫球蛋白中 I gG 含量測定方法提供了依據(jù) 。 關鍵詞 I gG; 高效親和色譜法 ; 紫外分光光

2、度法 ; 酶聯(lián)免疫法 中圖分類號 R927. 2 文獻標志碼 A 文章編號 100829926(2010 0620517204 DOI 10. 3969/j . issn . 100829926. 2010. 06. 014A Co m par ison of Three M ethods for D eterm i n a ti on of the Con ten t of Ig G i n Hu man Im m unoglobuli n Prepara ti on s for I n travenous I n jecti on(IV IG WANG M iao , XUE Q iao

3、2ru , Y AO M in 2fei , X I E Zheng 2fu Guangdong I nstitute f or D rug Contr ol, 510180, School of Che m istry and Che m ical Engineering of Sun Sen China; Guangdong Food and D rug Ad m inistrati on Center for 510080, China Abstract O bjecti ve To co mpare on of the content of I gG in intravenous in

4、 2 jecti on . M ethods H igh 2perfor the i m munos orbent assay and ultravi olet s pectr ophot ome 2 try were used t o I in injecti on . Results The statistical analysis showed that there was w een the results obtained fr om ultravi olet s pectr ophot ometry, high 2perf or mance af 2 finity and the

5、linked i m munos orbent assay, but no significant difference bet w een the results of high 2perf or m 2 ance affinity and the enzy me 2linked i m munos orbent assay . The result of the rep r oducible test fr om high 2perfor mance affinity was the best a mong the three methods . Conclusi on This stud

6、y hel p s choose a p r oper method t o deter m ine the content of I gG in intravenous injecti on . Key words I gG; high 2perf or mance affinity; ultravi olet s pectr ophot ometry; enzy me 2linked i m munos orbent assay I gG 是機體免疫中起保護作用的重要抗體 , 可抗 菌、 抗病毒 ; 應對麻疹、 甲型肝炎等 , 能有效地預防相 應的感染性疾病。 I gG 是靜脈注射人免疫球

7、蛋白的 主要成分 , 測定 I gG 含量對靜脈注射人免疫球蛋白的 質(zhì)量控制很關鍵 1, 2。 I gG 的檢測方法很多 , 本文采 用紫外分光光度法、 酶聯(lián)免疫法、 高效親和色譜法 3種不同原理的分析方法 , 對靜脈注射人免疫球蛋白中 I gG 進行含量測定 , 考查各方法并對結果作比較 , 為 靜脈注射人免疫球蛋白的質(zhì)量監(jiān)控提供依據(jù)。作者簡介 :王 淼 , 碩士 , 主管藥師。研究方向 :生物制品及生化藥 品標準研究 。 Tel:(020 81887684; E 2mail:wm8077hotm ail . com 作者單位 : 510180廣東廣州 , 廣東省藥品檢驗所生化室 ; 510

8、275廣東廣州 , 中山大學化學與化學工程學院 ; 510080廣東 廣州 , 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評認證中心 1 儀器與試藥 UV 22550紫外可見分光光度計 (日本島津制作 所 ; 1100系 列 高 效 液 相 色 譜 儀 、 紫 外 檢 測 器 (VWD (美國安捷倫公司 ; Sepctre Max 190酶標儀 (美國分子儀器公司 ; H iTrap T M Pr otein G HP (1m l 色譜柱 (GE Healthcare ; 人免疫球蛋白 (I gG EL I S A 定量試劑盒 (美國 R&D 公司 ; M illi 2Q 超純水儀 (M ill po

9、re ; 正常人血清免疫球蛋白國家標準品 (中 國藥品生物制品檢定所 , 批號 :20030101 ; 凍干抗人 I gG 血 清 (中 國 藥 品 生 物 制 品 檢 定 所 , 批 號 : 20070101 ; 靜脈注射人免疫球蛋白 (不同廠家的 5批 樣 品 , 批 號 分 別 為 :200909413、 200909414、 200909716、 200909719、 20091010 ; PEG6000(廣州 7 1 5 解放軍藥學學報 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber

10、20, 2010 天馬精細化工廠 ; Tris (Sanland 2Che m ; 其余試劑均 為分析純 。2 方法與結果2. 1 紫外分光光度法 32. 1. 1 溶液的制備 (1 抗體緩沖液 稱取 Tris 12. 42g 、 NaCl 9g 、 PEG600050g 、 B S A 1g 、 NaN 3 1g, 加水溶解 , 用 1mol/L鹽酸調(diào) pH 至 7. 4, 加水 稀釋至 1L 。 (2 抗體液 用抗體緩沖液將凍干抗 人 I gG 血清溶解并稀釋成抗體效價為 1 4, 混勻 , 0. 45m 膜濾過 , 4 保存?zhèn)溆?。 (3 標準品溶液 用生理氯化鈉溶液將 I gG 國家標

11、準品進行梯度 稀釋 , 將樣品進行 20、 30、 40倍稀釋 , 取稀釋的樣 品和標準品各 10l 于試管中 , 加入預熱至 37 的 抗體液 1m l 混勻 , 37 水浴保溫 1h 。 340nm 波長 測定吸收值 。2. 1. 2 線性關系考察 將 I gG 國家標準品依次稀 釋成 4. 2、 2. 1、 1. 05、 0. 52、 0. 26mg/ml, 按上述方法 進行試驗 , 得標準曲線方程為 : Y =0. 7821X -0. 1992, R 2=0. 結果表明 I gG 在 2關系良好 。2. 1. 3重 驗 同 一 批 號 (批 號 : 200909413 6次 , 6次測

12、 得的 I gG 含量平均值為 51. 0mg/ml, RS D 為 2. 6%。 2. 1. 4 回收率試驗 取已測定含量的靜注人免疫 球蛋白 (批號 :200909413 供試品溶液 , 分別加入 3種不同量的 I gG 標準品溶液 , 分別測定 , 結果見表 1。表 1 回收率試驗測定結果 (n =9樣品量 ( 加入量(測得量(回收率(x(RS D (1. 021. 202. 311107. 61. 202. 352111. 01. 202. 250102. 51. 021. 002. 158113. 81. 002. 225120. 5113. 35. 6 1. 002. 248122

13、. 81. 020. 801. 964118. 00. 801. 909111. 10. 801. 918112. 32. 1. 5 含量測定 取靜脈注射人免疫球蛋白供試 品 5批 , 按本文方法進行測定 , 計算供試品中 I gG 的 含量 , 結果見表 2。表 2 含量測定結果 (n =2批號 I gG 含量 (mg/ml 20090941351. 020090941451. 320090971653. 120090971952. 12009101049. 72. 2 高效親和色譜法2. 2. 1溶液的 制備 (1 流 動 相 A 液 0. 05 mol/L磷酸鹽緩沖液用氫氧化鈉調(diào)至 pH

14、6. 5; (2 流 動相 B 液 0. 07mol/L甘氨酸 2鹽 酸緩沖液用鹽酸 調(diào)至 pH2. 5; (3 對照品溶液 球蛋白國家標準品 ,度為 1. l 精 1. 0, 用注射 l0. 45m 濾膜 。. 2色譜條件 色譜柱 :H iTrap T M Pr otein G HP 色譜 柱 ; 檢 測 波 長 :280n m; 柱 溫 :25 ; 進 樣 量 : 20l; 流速 :0. 4m l/min; 梯度洗脫程序 , 見表 3。 表 3 梯度洗脫表時間(流速(A(B(0. 000. 410004. 500. 410005. 500. 4010015. 000. 4010015. 5

15、00. 4100023. 000. 410002. 2. 3 系統(tǒng)適用性試驗 按上述色譜條件進樣 , 得 對照品 、 供試品及空白圖譜 , 見圖 1, 空白無干擾 , 理 論板數(shù)按 I gG 峰計算可達 10000以上 , 且與相鄰雜 質(zhì)峰的分離度均能達到要求 。2. 2. 4 精密度試驗 取 I gG 對照品溶液 20l, 連 續(xù)進樣 6次 , 記錄峰面積 , 并計算 RS D 為 0. 5%, 表 明該方法的精密度較好 。2. 2. 5 線性關系考察 取 I gG 標準品依次稀釋成 濃度為 2. 0、 1. 5、 1. 0、 0. 5、 0. 25mg/ml 的溶液 , 分別 進樣 20l

16、, 平行進樣 2次 。 以峰面積對濃度進行回 歸 , 得回歸曲線和回歸方程為 : Y =5731. 4X -51. 7, R 2=0. 9998815 解放軍藥學學報 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber 20, 2010 A:對照品 ; B:供試品 ; C:空白 ; 1:lgG圖 1 HP LC 色譜圖 線性試驗結果顯示 , 在 0. 252. 0mg/ml 濃度 范圍內(nèi) , I gG 峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系 2. 2. 6 穩(wěn)定性試驗 3、 612、 24h 分別進樣 20

17、, 前 3次進樣 I gG 1. , 6次進樣 I gG 5. 。說明供試品溶液在配制后 6h , 則溶液制 備后應及時進樣 。2. 2. 7重 復 性 試 驗 取 同 一 批 號 (批 號 :200909413 樣品 , 制備 6份供試品溶液 , 測定 , 6份 供試品 I gG 平均含量為 40. 2mg/ml, RS D 為 0. 8%。 結果顯示該方法的重復性良好 。2. 2. 8 檢測限與定量限 取對照品溶液稀釋至適當濃度 , 進樣 , 以 I gG 的峰達信噪比 23和 810倍時的量分別為最低檢測限和最低定量限 , 最低檢 測限為 2g, 最低定量限為 6g 。2. 2. 9 回

18、收率試驗 取已測定含量的靜脈注射人免疫球蛋白 (批號 :20090413 供試品溶液 , 分別加 入 3種不同量的 I gG 標準品溶液 , 分別進樣 , 結果見 表 4。2. 2. 10 樣品測定 取靜脈注射人免疫球蛋白供試品 5批 , 按本文方法進行測定 , 記錄色譜圖 , 計算供 試品中 I gG 的含量 , 結果見表 5。2. 3 酶聯(lián)免疫法 (E L I S A 4 本法采用人免疫球 蛋白 (I gG EL I S A 定量試劑盒 , 操作照說明書步驟進 行 , 將標準品稀釋成 60、 40、 20、 10、 5g/ml 5個濃 度 , 于 96孔酶標板中每孔加入 50l 標準品和待

19、測樣品 , 各重復 2孔 , 37 孵育 30m in, 加入底物 T MB顯色 15m in, 終止反應 , 450nm 測定吸收值 , 據(jù)校準 曲線計算出待測樣品的 I gG 含量 。表 4 回收率試驗測定結果 (n =9樣品量( 加入量( 測得量( 回收率(x (RS D (0. 500. 320. 822100. 60. 80896. 30. 81197. 20. 500. 400. 86992. 397. 32. 50. 88796. 80. 89398. 30. 500. 480. 97398. 50. 96296. 30. 97999. 85 (=2批號I gG 含量 (mg/m

20、l 39. 02. 3. 1 線性關系考察 將標準品依次稀釋成 5個濃度 , 按上述方法進行試驗 , 以濃度對吸收值進行回歸 , 得標準曲線方程 : Y =0. 003X +0. 0408, R 2=0. 989 結果表明 I gG 在 560g/ml 范圍內(nèi)線性關系 良好 。 2. 3. 2 含量測定 取靜脈注射人免疫球蛋白供試 品 5批 , 按本文方法進行測定 , 計算供試品中 I gG 的 含量 , 結果見表 6。表 6 含量測定結果 (n =2批號I gG 含量 (mg/ml 20090941340. 720090941441. 320090971643. 320090971942.

21、42009101039. 53 討論3. 1 曲線比較 從 3種方法的線性試驗及各自的915 解放軍藥學學報 2010年 12月 20日 第 26卷 第 6期 Phar m J Chin PLA, VO l . 26, NO. 6, D ece m ber 20, 2010標準曲線可知 , 在一定濃度范圍內(nèi)高效親和色譜法 的相關線性優(yōu)于紫外分光光度法及酶聯(lián)免疫法 。 紫 外法中 , 將吸收值與 I gG 濃度直接進行線性回歸時 , 未能顯出良好正相關性 , 參照文獻進行雙對數(shù)回歸 后方顯良好的線性 。3. 2 回收率比較 從表 1和表 4可知 , 高效親和色 譜法的回收率結果優(yōu)于紫外分光光度法

22、 。3. 3 測定結果比較 從 3種方法的測定結果可知 , 紫外法的測定值高于高效親和色譜法和酶聯(lián)免疫 法 。 將高效親和色譜法的測定結果與紫外法測定結 果進行線性相關分析 , 其線性方程與相關系數(shù)分別 為 : Y =0. 9375X -7. 525, R 2=0. 9849 高效親和色譜法對酶聯(lián)免疫法 , 其線性方程與 相關系數(shù)分別為 : Y =1. 2265X -8. 4778, R 2=0. 9911 高效親和色譜法與紫外法和酶聯(lián)免疫法的測定 值之間呈正相關性 。 對 3種方法的測定結果分別進 t 檢驗分析 果見表 7。表 7t方法 Sig (雙尾 UV 2HP AC 40. 000 U

23、V 2EL I S A 13. 76740. 000 HP AC 2EL I S A 0. 87140. 409 由表 7可以看出 UV 法和 HP AC 法及 EL I S A 法 測定結果的顯著性差異 (P <0. 05 , HP AC 法與 EL I S A 法測定結果無顯著性差異 (P >0. 05 。 高效液相親和色譜法測定 IgG 是在特定條件 下 , I gG 能被吸附于其配基上 , 并利用洗脫液將其 洗脫進行定量分析 ; 紫外分光光度法是利用 I gG 在 37 能抗人 IgG 發(fā)生抗原 2抗 體反應 , 從而利用標 準品來對供試品 I gG 進行定量 ; 酶聯(lián)免疫

24、分析法是 用純化的抗 2IgG 抗體包被微孔板 , 制成固相抗體 , 在微孔中依次加入 I gG 、 HRP 標記的羊抗人抗體結 合 , 形成抗體 2抗 原 2酶 標抗體復合物 , 經(jīng)過徹底洗 滌后加底物 T MB 顯色 , 利用酶標儀測定吸收值 , 通 過標準曲線來定量供試品中 I gG 的含量 528。 高效親和色譜法精密度好 , 操作也較簡便 ; 紫 外分光光度法的重復性不如高效親和色譜法好 , 且需同時做幾個不同稀釋度進行實驗 , 操作相對 較繁瑣 , 且據(jù)該法測定原理可知 , 紫外分光光度法 是從測定反應液的濁度衍生而得 , 因此紫外分光 光度法的專屬性不如另外兩種方法 ; 酶聯(lián)免疫分 析法的缺點在于費用較高 。含量測定結果顯示 , 高效親和色譜法和酶聯(lián)免疫分析法與紫外分光光 度法相比較有顯著性差異 , 但高效親和色譜法和 酶聯(lián)免疫分析法并無顯著性差異 。 3種方法的測 定結果顯正相關性 , 其中高效親和色譜法操作