反義多重耐藥性基因抑制眼睫狀體非色素上皮細(xì)胞容積激活性氯電流

1、反義多重耐藥性基因抑制眼睫狀體非色素上皮細(xì)胞容積激活性氯電流    反義多重耐藥性基因抑制眼睫狀體非色素上皮細(xì)胞容積激活性氯電流    中國病理生理雜志 2000年第7期第16卷 論著    作者：陳麗新王立偉    單位：(廣東醫(yī)學(xué)院生理教研室，廣東 湛江 524023)    關(guān)鍵詞：離子通道；寡核苷酸類，反義；抗藥性；基因表達(dá)    摘要目的：研究多重

2、耐藥性(MDR1)基因及其產(chǎn)物P糖蛋白(P-gp)與容積激活性Cl-電流的關(guān)系。方法：用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)記錄牛眼睫狀體非色素上皮(NPCE)細(xì)胞容積激活性Cl-電流，反義寡核苷酸阻抑細(xì)胞MDR1基因表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測細(xì)胞P-gp免疫熒光。結(jié)果：P-gp免疫熒光與人源反義MDR1呈劑量依賴性減弱關(guān)系,容積激活性Cl-電流被人源反義MDR1特異性地部分阻抑，電流潛伏期延長，峰電流值減少，電流抑制率與人源反義MDR1呈現(xiàn)劑量依賴性增強關(guān)系,(r=0.99， P0.01)。 P-gp表達(dá)抑制率和容積激活性Cl-電流抑制率高度正相關(guān)(r=0.99， P0.01)。結(jié)論：MDR1基因及其產(chǎn)

3、物P-gp參與NPCE細(xì)胞容積激活性Cl-電流的形成。    中圖分類號Q 25文獻標(biāo)識碼A    文章編號1000-4718(2000)07-0658-05    Multidrug-resistance antisense inhibits volume-activated chloride    current in non-pigmented ciliary epithelial cells   &

4、#160;CHEN Li-xin, Wang Li-wei    (Department of Physiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)    AbstractAIM： To study the relationship between multidrug-resistance (MDR1) gene product P-glycoprotein (P-gp) and the volume-activated chloride c

5、urrent. METHODS:The volume-activated chloride current in bovine non-pigmented ciliary epithelial cells was recorded using a whole cell recording technique. An antisense technique was used to inhibit the expression of MDR1 gene. The immunofluorescence of P-gp was monitored with a real-time laser conf

6、ocal microscope.RESULTS:P-gp immunofluorescence correlated negatively with the concentration of the human MDR1 antisense oligonucleotide. The antisense oligonucleotide inhibited the volume-activated chloride current specifically and partially. The latency of activation of the current increased and t

7、he peak current decreased. The percentage of inhibition of peak current correlated positively to the concentration of the antisense oligonucleotide(r0.99, P0.01) and to the reduction(%) of P-gp immunofluorescence(r=0.99,P0.01).CONCLUSION:P-gp, the product of MDR1 gene, plays an important role in the

8、 activation pathway of volume-activated chloride current in non-pigmented ciliary epithelial cells.    MeSHIon channels; Oligonucleotides, antisense; Drug resistance; Gene expression    睫狀體非色素上皮(non-pigmented ciliary epithelium, NPCE)細(xì)胞分泌房水機制與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)有關(guān)。NPCE容積激活

9、性Cl-通道起著調(diào)控房水分泌速率的重要作用1。資料表明,多重耐藥性(multidrug-resistance， MDR1)基因可能參與容積激活性氯電流的形成2。MDR1基因產(chǎn)物P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在容積激活性氯電流的形成中的作用如何仍未確定。本研究用基因阻斷技術(shù)(antisense technique)阻斷NPCE的MDR1基因表達(dá),觀察容積激活性氯電流的改變,以闡明二者之間的關(guān)系。    材料和方法    一、細(xì)胞分離和培養(yǎng)    睫狀體上皮

10、細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法見文獻3。    二、反義寡核苷酸處理細(xì)胞    本實驗所用鼠源和人源兩種MDR1反義寡核苷酸(MDR1 antisense oligonucleotide,反義MDR1，Severn Biotech Ltd, UK)用高效液相層析法提純，其序列詳見文獻3。用陽離子脂質(zhì)體lipofectin (Gibco BRL, USA)促進細(xì)胞攝取反義寡核苷酸。    實驗分組:空白對照組;陽離子脂質(zhì)體組(lipofectin 20 mg/L);鼠源反義MDR1組(M

11、-LA; lipofectin 20 mg/L和鼠源反義MDR1各10、50、100、200 mg/L);人源反義MDR1組(H-LA; lipofectin 20mg/L和人源反義MDR1各10、50、100、200 mg/L)。各處理組分別在E199培養(yǎng)液中加入上述藥物,培養(yǎng)48 h 后, 進行P-gp免疫熒光標(biāo)記和測定,記錄全細(xì)胞電流。    三、P-gp免疫熒光測定    用免疫熒光法檢測P-gp的水平，以了解反義MDR1阻抑MDR1基因的程度。細(xì)胞培養(yǎng)、處理48 h后，磷酸鹽(PBS)溶液漂洗細(xì)胞，聚甲醛

12、固定，Triton X-100浸浴，羊血清封閉，JSB-1陽性對照組和處理組加入小鼠抗P-gp抗體JSB-1 (Monosan, Netherlands), 置于冰箱中過夜(1416 h)。JSB1陰性對照組不加抗體JSB1。加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠Ig-G(Sigma)，置暗處孵育1 h，在激光共聚焦顯微鏡(Noran Instruments, USA)下檢測熒光，用metamorph圖像分析系統(tǒng)(Universal Imaging Corporation, USA )拍攝、分析圖像，熒光強度(灰白度)單位：Unit，0 Unit最弱，255 Unit最強。   

13、; 四、全細(xì)胞記錄    用EPC-7膜片鉗放大器(list electronic, Germany)記錄單獨的NPCE細(xì)胞全細(xì)胞電流。微電極尖端電阻510 M。電流和電壓信號用CED1401(Cambridge, UK)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz)，實驗數(shù)據(jù)用EPC(CED, Cambridge, UK)軟件分析。鉗制電壓模式：細(xì)胞被鉗制在0 mV, 以0, ±40, ±80 mV不斷反復(fù)循環(huán)，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s。細(xì)胞玻片安放在灌流槽中，用等滲液灌流5 min, 記錄穩(wěn)定的背景電流，改灌低滲液，待電流

14、升高7 min后，重新灌流等滲液，連續(xù)觀察和記錄電流。實驗在室溫(2024)下進行。    五、溶液    使用特配的溶液以記錄Cl-電流。電極液含(mmol/L):105 N-methyl-d-glucamine chloride (NMDG-Cl), 1.2 MgCl2, 10 Hepes, 1 EGTA, 70 D-manitol, 2 ATP。等滲灌流液含(mmol/L):105 NaCl, 0.5 MgCl2, 10 Hepes, 70 D-manitol。 低滲灌流液除不含D-manitol外，其它成份

15、及濃度與等滲灌流液相同。電極液和等滲灌流液用蔗糖調(diào)至滲透壓300 mOsm/L,低滲灌流液調(diào)至230 mOsm/L。電極液和灌流液用Tris液分別調(diào)至pH 7.25和7.40。    六、統(tǒng)計方法    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)差異顯著性用t檢驗判定。    結(jié)果    一、P-gp免疫熒光    在激光共聚焦顯微鏡下，P-gp特異抗體JSB-1陰性對照組細(xì)胞只顯示

16、微弱的自發(fā)熒光(14.7±12.9，n=46)。而JSB-1陽性對照組細(xì)胞(91.4±26.9，n=53)和lipofectin組細(xì)胞(87.0±23.5，n=48)顯示較強的熒光,兩組熒光值沒有顯著差異，表明NPCE細(xì)胞存在P-gp蛋白，lipofectin對MDR1基因表達(dá)沒有影響。鼠源反義MDR1組細(xì)胞的熒光值(MLA200； 95.2±25.3， n=22)與JSB-1陽性對照組無顯著差異(P0.05)。人源反義MDR1組P-gp熒光明顯弱于陽性對照組，并且隨著反義MDR1濃度增加，P-gp熒光逐漸減弱(圖1),兩者高度負(fù)相關(guān)(r=-0.94，

17、P0.01), HLA 200組P-gp熒光弱至30.7±27.1,表明人源反義MDR1有效地抑制NPCE細(xì)胞MDR1基因表達(dá),減少其產(chǎn)物P-gp蛋白合成,而且減少的程度與反義MDR1濃度有關(guān)。而鼠源反義MDR1則無此作用。        Fig 1Dose-dependent reduction of P-gp immunofluorescence caused by human MDR 1-antisense (±s) (n)    1人源反義MDR1

18、對P-gp免疫熒光的劑量依賴性抑制作用    二、全細(xì)胞電流    (一)容積激活性Cl-電流如圖2A所示,對照組細(xì)胞被鉗制在0,+40,-40, +80, -80 mV(鉗制電壓模式見2C),在等滲液灌流期間僅記錄到微弱的背景電流,在12個細(xì)胞上觀測到相同的結(jié)果。然而，以230 mOsm/L的低滲液灌流時,記錄到一個幾乎不失活、持續(xù)、較大的電流，其外向電流(向上)和內(nèi)向電流(向下)均顯著增加,但外向電流占優(yōu)勢。2B顯示低滲液灌流9 min瞬時記錄的電流。圖2D顯示實驗全過程電流變化(在每個鉗制脈沖第10 ms處采

19、樣)。在低滲液灌流13 min后,電流開始上升,持續(xù)灌流低滲液,電流持續(xù)增加,電流上升57 min后,上升速度減弱趨向平穩(wěn),將上升7 min時的電流值作為峰電流。重新灌流等滲液時,電流逐漸衰減,直至基本恢復(fù)到低滲液灌流前的對照水平,恢復(fù)時間大約1030 min。    在等滲液灌流10 min和低滲液灌流產(chǎn)生電流后7 min記錄電流,作電流-電壓曲線(2E)。由于電極液和灌流液兩種液體均不含K+，Cl-濃度幾乎完全相等,氯離子平衡電位(ECl)等于零。測得低滲液激活的電流在(-4.9±0.5) mV反轉(zhuǎn),很接近氯離子平衡電位。Cl-通道阻斷劑t

20、amoxifen基本阻斷此電流(阻抑率87.6, n=5，P0.01),因此,Cl-是形成此電流的主要離子(詳見討論)，此電流是容積激活性Cl-電流。    Lipofectin組細(xì)胞對低滲液刺激引起的電流反應(yīng)與對照組相似。    (二)反義MDR1對容積激活性Cl-電流的影響鼠源反義MDR1組細(xì)胞對低滲液刺激下的全細(xì)胞電流反應(yīng)和電流-電壓曲線與對照組相似(圖3A),M-HL各組產(chǎn)生容積激活性Cl-電流的潛伏期和峰電流與對照組相比均無顯著差異(表1)。    人源反義MDR1

21、明顯抑制低滲液激活的Cl-電流，表現(xiàn)為潛伏期顯著延長,峰電流明顯減弱，其全細(xì)胞電流反應(yīng)和電流-電壓曲線見圖3B。潛伏期及峰電流值詳見表1。    三、人源反義MDR1劑量與P-gp免疫熒光和容積激活性Cl-電流的關(guān)系    Fig 2Volume-activated chloride current (±s，n=12) iso: isotonic solution; Hypo: hypotonic solution    2容積激活性氯電流  &

22、#160; Fig 3Effect of MDR1-antisense on volume-activated chloride current (±s, a:n=8, B:n=25)    3反義MDR1對容積激活性氯電流的影響    表1反義MDR1對容積激活性氯電流的影響    Tab 1Effects of MDR1-antisense on volume-activated chloride current （±s) 

23、0;          Group    n    Latency (s)    Current    (Isotonic)(pA)    Current    (Hypotonic) (pA)     

24、60;      Control    12     126.9±84.5     38.8±15.5    1 596.3±368.9            Lipofectin    1

25、5    118.4±73.2    39.9±13.9    1 471.3±382.7            M-LA10    13    122.9±74.3    42.8±16.

26、6    1 607.1±311.5            M-LA 50    7    129.3±95.5    41.1±22.5    1 549.0±203.2     

27、0;      M-LA 200    8    130.2±61.4    43.3±19.0    1 569.5±224.6            H-LA 10    10 

28、;   174.3±87.0    48.1±13.3    1 379.7±273.5            H-LA 50    9    *    37.0±9.9   &#

29、160;*            H-LA 100    13    *    44.3±17.3    *            H-LA 200   

30、60;25    *    41.6±18.5    *            * P0.05, * P0.01， vs control隨著人源反義MDR1濃度的提高,對容積激活性Cl-電流的抑制作用逐漸增強(圖4),即容積激活性Cl-電流的抑制率與人源反義MDR1呈劑量依賴性增強關(guān)系,兩者呈高度正相關(guān)(r=0.99, P0.01)。人源反義MDR

31、1對P-gp表達(dá)的抑制率與其對容積激活性Cl-電流的抑制率相似,兩種抑制率間高度正相關(guān)(r=0.99, P0.01)。表明P-gp表達(dá)水平高低直接影響容積激活性Cl-電流的大小。        Fig 4Blocks (%) of P-gp immunofluorescence and volume-activated chloride current by human MDR1-antisense (±s， n)    4人源反義MDR1對P-gp免疫熒光和容積激

32、活性氯電流的抑制百分率    討論    本實驗結(jié)果顯示在低滲液刺激下NPCE細(xì)胞產(chǎn)生一個較強的電流。本實驗所用電極液(細(xì)胞內(nèi)液)和灌流液(細(xì)胞外液,包括等滲液和低滲液)主要離子是Cl-, Na+, Ca2+,細(xì)胞內(nèi)外液Cl-濃度相等,細(xì)胞外液Na+, Ca2+濃度高于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞被鉗制在電壓0, +40, -40, +80, -80 mV,在等滲液灌流條件下,基本沒有電流產(chǎn)生,表明此時低電導(dǎo),基本沒有通道開放。在低滲液灌流時,當(dāng)鉗制電壓為0 mV時,沒有電流產(chǎn)生, 表明Na+, Ca2+通道不開放,雖然細(xì)胞外液

33、Na+, Ca2+濃度高于細(xì)胞內(nèi),但由于這些離子通道不開放,故沒有內(nèi)向電流產(chǎn)生,當(dāng)鉗制電壓為80 mV時,出現(xiàn)一外向電流,外向電流方向與Na+, Ca2+由于化學(xué)濃度差所形成離子內(nèi)流的流動趨勢相反,因此，此電流不可能是Na+, Ca2+等正離子外流而形成,而只能是負(fù)離子內(nèi)流而形成。本實驗灌流液中唯一的負(fù)離子是Cl-,所以此電流只能是Cl-內(nèi)流而形成。當(dāng)鉗制電壓為80 mV時,則剛好相反, Cl-外流,形成內(nèi)向電流。容積激活性Cl-電流反轉(zhuǎn)電壓-4.7 mV,與氯離子平衡電位(ECl=0)非常接近,而此條件下，Na+、Ca2+平衡電位大于+200 mV,也表明此容積激活性電流是Cl-攜帶形成。C

34、l-通道阻斷劑tamoxifen基本阻斷此電流，更證明此電流是Cl-電流。    MDR1基因產(chǎn)物P-gp在容積激活性氯電流的形成中的作用如何，有許多爭議46。我們以往的工作表明，MDR1基因與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)有關(guān)3。本實驗用基因表達(dá)抑制劑人源反義MDR1特異性阻抑MDR1基因表達(dá)后，該基因產(chǎn)物P-gp減少，容積激活性Cl-電流減弱，P-gp免疫熒光與容積激活性Cl-電流之間高度正相關(guān)。而鼠源反義MDR1對P-gp免疫熒光和容積激活性Cl-電流都沒有影響，因此，可以認(rèn)為MDR1基因通過其產(chǎn)物P-gp參與容積激活性Cl-電流的形成。  &#

35、160; 本研究用人源反義MDR1最高濃度為200 mg/L, 只能部分抑制容積激活性Cl-電流,其中原因之一可能是NPCE細(xì)胞存在著與其它基因有關(guān)的Cl-電流7，8,換言之，MDR1基因并非唯一與容積激活性Cl-電流有關(guān)的基因，這有待于進一步的實驗證實。容積激活性Cl-電流及細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減小與房水分泌有關(guān)。本研究結(jié)果提示，可以通過調(diào)控MDR1基因及其產(chǎn)物P-gp來調(diào)節(jié)房水的分泌，從而為在基因水平上治療青光眼提供新的途徑。        參考文獻    1Coca-Prados M, Anguita J, Chalfant ML, et al. PKC-sensitive Cl- channels associated with ciliary epithelial homologue of pIClnJ. Am J Physiol, 1995, 268: C572C579.    2Valverde MA, Diaz M, Sepulveda M, e