單克隆抗體制備的基本原理

1、單克隆抗體制備的基本原理、單克隆抗體的概念抗體(antibody )是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫 球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而 抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì) 成分。一般的 抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體 也是針對多個不同 抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定 簇的常規(guī)血清抗體, 仍是由不同B細胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多 克隆抗體(Polyclonal anybody ),簡稱多 抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性 質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很 大，使它在

2、免疫化學(xué)試驗等使用中 帶來許多麻煩。因此，制備針對預(yù)定 抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無限量供 應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長期夢寐以求的目標。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這 目標得以實現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù) 定抗原免疫的小鼠脾細胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細胞 融合, 形成B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征，既像 骨髓瘤細胞樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾 淋巴細胞那樣合 成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交 瘤細胞的單克隆系, 即雜交瘤細胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原 決定簇的高度同質(zhì)的抗 體，

3、即所謂單克隆抗體(monoclonal antibody , McAb,簡稱單抗。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供 應(yīng)。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次*,而且它在生 物醫(yī)學(xué) 科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進了眾多學(xué)科的發(fā)展。德國科學(xué)家柯勒(Georges Koler )和英國科學(xué)家米爾斯坦(Cesar Milstein )兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。、雜交瘤技術(shù) (一)雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論 和技術(shù)兩方面發(fā) 展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研 究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合

4、成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提 供了必要 理論基礎(chǔ)，同時，骨髓瘤細胞的體外培養(yǎng)、細胞融合與雜交細胞的 篩選 等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日，Kohler和M訂stein在英國自 然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培 養(yǎng)" (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity )的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤 細胞之 間的融合延伸為將喪失合成次黃瞟吟-鳥卩票吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,HGPR)T 的(hypoxanthine guan

5、osine phosphoribosyl transferase骨髓瘤細胞與經(jīng)綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病 毒介 導(dǎo)，雜交細胞通過在含有次黃票吟(hypoxanthine , H)、氨基喋 吟(aminopterin , A)和胸腺噪核昔(thymidi ne , T)的培養(yǎng)基(HAT中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里，盡管未融合的正常脾細胞和 相互融合的脾細胞是HGPRT,但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾 天，而 未融合的HGPRT骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT骨髓瘤細胞不 能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本 脾細胞的

6、HGPR和口親本骨髓瘤細胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活 下來。實驗的結(jié)果完全像起始設(shè)計的那樣, 得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注 射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹 水中含有 大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG的融合效果更好，1 避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Agl4, X63-Ag8. 653和NSO/1都是既不合成輕鏈 又不合成重鏈的變種, 所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細

7、胞系，只分泌一種針 對預(yù)定的抗原的抗體分子,克服了骨髓瘤細胞M0PC-2等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細胞融合的骨髓瘤細胞系，但其基本原 理 和方法是一樣的。(二)雜交瘤技術(shù)的基本原理 細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾 細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合 細胞懸中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)，如 融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合 的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活 僅57 天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需 進行特別的篩選去除。在細胞融合后，要從上述五種細胞中篩選岀雜交瘤細

8、 胞，一般使用HAT培養(yǎng)進行篩選，HAT培養(yǎng)基中含有 次黃瞟吟(H)、氨基喋吟 (A)和胸腺喘唏(T)三種成分。細胞的DNA合成 有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和 外源性途徑（旁路途徑）兩種方式。內(nèi)源性途 徑就是利用谷氨酰胺或單磷酸 尿昔酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合 成DNA而外源性途徑則是利用次黃卩票 吟或胸腺卩密唏在次瞟吟鳥瞟吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT或胸腺口密唳激酶（thymidine kinase, TK）的催化下來補救合成DNAHAT培養(yǎng)基中氯基喋吟是二氫葉酸還原酶的抑制劑，能有效地阻斷DN

9、A合成的內(nèi)源 性途徑。B淋巴細胞具有HGPRTT這兩種酶，因此在內(nèi) 源性途徑被阻斷后仍能 利用HAT培養(yǎng)基中的次黃瞟吟和胸腺嘻:噪來合成DNA可在HAT培養(yǎng)基中存 活，但B淋巴細胞是正常細胞，故不能長期 存活。雜交瘤技術(shù)中所使用和SP2/0-Agl4骨髓瘤細胞為HGPRT的TK-缺陷型，缺乏HGPR酶和TK酶在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進行DNA的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜 交瘤細胞由于繼承了 B淋 巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，能夠合成HGPR 酶和TK酶，故在HAT養(yǎng)基中能長期存活。因此將融合后的混合細胞在HAT培 養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周 后，只有雜交瘤細胞能存活下來，成為制造單克隆抗

10、體的細三、單克隆抗體制備的方法與步驟（一）單抗制備的基本流程 單克隆抗體制備的主要步驟有：正常小鼠免疫處理；用物理、化學(xué) 和生物方法促使細胞融合；雜交瘤細胞的篩選與培養(yǎng)；單克隆抗體的提 純。（二）單克隆抗體制備的基本方法 抗原提純與動物免疫對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的 抗原。如為細胞抗原，可取IX 107個細胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓油耆Ｊ献魟┎⒔?jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在 的電泳 條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/C健康小鼠，鼠齡在812周，雌雄不 眼。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫34只

11、小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免 疫途 徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般 周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產(chǎn)生高效價特異 抗體 的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量(如抗體的濃度和親和力)也與免疫 過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后34天，分離 脾細胞融合。骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備 選擇瘤細胞株的最重要的一點是與待融合的 B細胞同源。如待融合的是脾細胞，各種骨髓瘤細胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳，此外，該細胞株本身不分泌任何免疫球 蛋白重鏈或輕鏈。細胞的最高生長刻

12、度為9X 105/ml,倍增時間通常為1015h。融合細胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細胞形態(tài)和活性佳的細胞(活性應(yīng)大于95%) O骨髓瘤細胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥卩票吟的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為2105/nil，次日一 般即為對數(shù)生長期細胞。在體外培養(yǎng)條件下，細胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募毎芏?，因而，在培養(yǎng)融 合細 胞或細胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細胞(feedercell )常用的飼養(yǎng)細胞為小鼠的腹腔細胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹 部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞，其中在巨噬 細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞

13、作為飼 養(yǎng)細胞的。在制備飼養(yǎng)細胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細胞會有嚴重 污染。飼養(yǎng)細胞調(diào)至IX 105/nib提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。細胞融合 細胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG消除PEG勺作用。將融 合后的 細胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應(yīng) 特別注意。細胞比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10 不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。 反應(yīng) 時間：在兩種細胞的混合細胞懸液中，第Imin滴加45ml培養(yǎng)液；間隔 2rnin滴加5inl培養(yǎng)液，爾后加

14、培養(yǎng)液50ml培養(yǎng)液的成分：對 融合細胞， 良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴格配 制。如融合效率降低，應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。有限稀釋法 篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株，所以只有融合的細胞 才能待續(xù)存活一周以上。融合細胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后(一般稀釋至0.8個細胞/孑L),按Poisson法計算，應(yīng)有36%的孔為1個細胞/孔。細胞培養(yǎng)至覆蓋0 %20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，爾后進行 抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細胞 株擴大培養(yǎng)或凍存。單克隆抗體的制

15、備和凍存 篩選岀的陽性細胞株應(yīng)及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養(yǎng)時間延 長，發(fā)生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加?？贵w制備有兩種方 法。是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗 體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體 的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn) 生，每只小鼠可收集5lOml的腹水，有時甚至超過40mlO該法制備的腹 水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此夕卜，腹水中的雜蛋

16、 白也較少，便于抗體的純化。接種細胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5X 105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當(dāng)增減。選出的陽性細胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細 胞株 活性僅有輕微的降低，而凍存在-70 C冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞颯(DMS) 0是普遍應(yīng)用的 凍存保護劑。凍存細胞復(fù)蘇后的活性多在50%95%之間。如果低于50%,則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。單克隆抗體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性 抗體的濃度較 抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同 采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達 到純化