鈉氫交換蛋白-1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪對HL-60ADM細胞pHi變化及細胞增殖、凋亡的影響

1、鈉氫交換蛋白-1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪對HL-60/ADM細胞pHi變化及細胞增殖、凋亡的影響         08-03-03 16:34:00     編輯：studa20          作者：常城，孔佩艷，陳幸華，彭賢貴，劉林，劉紅，曾東風(fēng)，梁雪，王慶余【摘要】  為了探討鈉氫交換蛋白-1（NHE-1）抑制劑二甲基氨氯吡咪（DMA）對HL-60/ADM細胞pHi變

2、化及細胞增殖、凋亡的影響，以敏感HL-60細胞為對照，用不同濃度的DMA干預(yù)后，熒光指示劑（BCECF/AM）檢測法檢測細胞內(nèi)pHi，微量噻唑藍法（MTT）檢測細胞生長的抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，TUNEL法檢測原位細胞凋亡，對比HL-60/ADM細胞與HL-60細胞之間的差異。結(jié)果顯示： HL-60/ADM細胞內(nèi)pHi較HL-60細胞顯著升高；DMA作用下，HL-60/ADM細胞的pHi降低幅度、生長抑制率、細胞凋亡率均顯著高于HL-60細胞；當(dāng)DMA濃度100-150 mol/L時，HL-60/ADM細胞的G0/G1期細胞比率增加幅度、S期及G2/M期細胞比率降低幅度均高于HL-

3、60細胞。 結(jié)論： NHE-1特異性抑制劑DMA引起HL-60/ADM的pHi降低，可抑制細胞生長并誘導(dǎo)細胞凋亡；且DMA對HL-60/ADM細胞的生長抑制作用顯著高于HL-60細胞。 【關(guān)鍵詞】  鈉/氫交換蛋白-1Effect of the NHE-1-Specific Inhibitor DMA on pHi，Proliferation and Apoptosis of HL-60/ADM Cells In VitroAbstract    The aim of this study was to evaluate the effect of di

4、methyl amiloride (DMA)，a specific inhibitor of Na+/H+ exchanger-1 (NHE-1)，on intracellular pH value(pHi)，proliferation and apoptosis of HL-60/ADM cells in vitro. After  treatment  with DMA at different doses，pHi of HL-60 and HL-60/ADM cell lines were determined by using pH-sensitive fluore

5、scence dye BECEF-AM;  the rate of growth inhibition of cells was detected with MTT assay;  cell cycle was detected by flow cytometric DNA analysis; cell apoptosis was observed with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The results showed that pHi in

6、 HL-60/ADM cells was higher than that in HL-60 cells. After treatment  with DMA at different doses，pHi decreased，the rate of growth inhibition and the rate of apoptotic cells in HL-60/ADM cells were all higher than those in HL-60 cells. Meanwhile，after treatment with DMA during 100 mol/L to 150

7、 mol/L，the increase amplitude of  G0/G1 phase cells  and the decrease amplitude of  SG2/M  cells in HL-60/ADM cells were higher than those in HL-60 cells. It is concluded that by  causing intracellular acidification，the NHE-1-specific inhibitor DMA inhibits proliferation

8、0; of  HL-60/ADM cells   and induces apoptosis of HL-60/ADM cells，and the degree of this growth inhibition of HL-60/ADM cells is higher than that of HL-60 cells.Key words  NHE-1;  dimethyl amiloride; HL-60/ADM cell; pHi; cell proliferation; apoptosis鈉/氫交換蛋白-1（Na+/H+exchanger

9、-1，NHE-1）廣泛存在于真核細胞膜上，介導(dǎo)細胞內(nèi)外11鈉/氫交換以維持細胞內(nèi)的pH值（intracellular pH value，pHi）。NHE-1表達增高和（或）活化可引起細胞內(nèi)堿化，促進細胞增殖，相反則可導(dǎo)致細胞內(nèi)酸化，促進細胞凋亡1，2。凋亡抑制是白血病多藥耐藥（MDR）產(chǎn)生的重要機制之一3，本研究以HL-60細胞株為對照，檢測NHE-1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪（dimethyl amiloride，DMA）作用下，阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生多藥耐藥的HL-60細胞株（HL-60/ADM）pHi改變及其細胞增殖、凋亡變化，探討DMA對HL-60/ADM細胞生長的影響。材料和方法材料細胞株H

10、L-60細胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)復(fù)合傷研究所提供。阿霉素誘導(dǎo)的耐藥HL-60細胞株(HL-60/ADM)購自天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實驗前經(jīng)檢測證實，該細胞株對臨床常用多種化療藥物耐藥，細胞表面表達多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP），細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶（Topo）增高。試劑及儀器 BCECF-AM購自美國Eugene公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、標準胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品，尼日利亞菌素（nigericin）、DMA、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。其他常規(guī)試劑為國內(nèi)試劑公司產(chǎn)品，分析純。美國PE公司LS-50B熒光分光光度計，國產(chǎn)酶聯(lián)免疫分析儀

11、。氯化鈉緩沖液（PSS，pH 7.4，37）、氯化鉀緩沖液（37下用1N鹽酸和1N氫氧化鉀分別調(diào)定pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）參照文獻4自行配制。MTT溶于PBS液，工作液濃度為5 mg/ml。細胞培養(yǎng)用含10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2），于飽和濕度，5 CO2、37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HL-60/ADM細胞株常規(guī)培養(yǎng)加入阿霉素0.5 g/ml，實驗前無藥培養(yǎng)1周。pHi檢測熒光強度比值（FIR）測定  按BCECF-AM法4進行。取對數(shù)生長期的細胞，以1×106細胞重懸于1 ml PBS液中；加入不同濃度DMA，37孵育3

12、0分鐘；加入BCECF-AM（終濃度1 g/ml），37孵育30分鐘；PSS漂洗后置于LS-50B分光光度計上用雙波長比例測量法檢測，激發(fā)波長為495 nm和440 nm，發(fā)射波長為530 nm。FIR495 nm/440 nm。pHi標準曲線制作  參照文獻4進行。細胞分別重懸于上述不同pH值氯化鉀緩沖液中，加入BCECF-AM、Nigericin（終濃度5 mol/L）孵育30分鐘，以pH值和對應(yīng)FIR求出回歸方程，作出pHi標準曲線。根據(jù)此曲線將檢測FIR轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的pHi值。細胞生長抑制率的MTT法檢測取對數(shù)生長期細胞，用含10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為

13、1×105/ml，接種于96孔板，0.2 ml/well。同時分別加入不同濃度DMA，每種濃度設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)置不加DMA的陰性對照孔和不加細胞的空白對照孔。常規(guī)培養(yǎng)48小時后加入MTT工作液20 l/well，孵育5小時，離心后棄上清，加入DMSO 0.15  ml/well，震蕩10分鐘使結(jié)晶充分溶解，酶標儀570 nm波長檢測OD值，根據(jù)OD值計算相應(yīng)抑制率。抑制率1（OD檢測OD空白）/（OD陰性O(shè)D空白）細胞周期檢測對數(shù)生長期細胞加入不同濃度DMA共同培養(yǎng)24小時，細胞懸液用70%的冷乙醇固定后，調(diào)整細胞濃度為106/ml；PI染色(50 g/ml)，4避光孵育30分鐘，在流式細胞儀(美國FACS)上進行檢測。原位細胞凋亡率檢測對數(shù)生長期細胞分別與不同濃度DMA共同培養(yǎng)12、24、48小時，離心涂片機涂片；采用TUNEL法，封片后光鏡高倍鏡（×400）下觀察，至少觀察5個視野，計數(shù)200個細胞以上，計算陽性細胞百分率。統(tǒng)計分析細胞周期檢測數(shù)據(jù)采用總體率假設(shè)檢驗。其余數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±SD）表示，用Microsoft