大鼠腦缺血再灌流后海馬氨基酸水平變化與神經(jīng)元損害的關系探討

1、    大鼠腦缺血再灌流后海馬氨基酸水平變化 與神經(jīng)元損害的關系探討        摘要目的探討腦缺血再灌流后海馬氨基酸遞質(zhì)變化與神經(jīng)元損害的關系。方法建立大鼠前腦缺血再灌流模型，測定海馬CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)游離氨基酸含量，觀察阻斷隔-海馬通路對海馬神經(jīng)元損害和氨基酸水平的影響。結果(1)海馬結構中僅CA1區(qū)神經(jīng)元明顯損害，但CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)的Glu、Asp和GABA含量無差異。(2)阻斷隔-海馬通路可明顯減輕海馬神經(jīng)元損害，但對海馬氨基酸水平變化無

2、影響。結論腦缺血再灌流后，氨基酸遞質(zhì)水平的異常變化不是海馬CA1區(qū)神經(jīng)元選擇性易損的唯一決定因素，隔-海馬通路末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)也參與海馬神經(jīng)元損害過程。關鍵詞腦缺血再灌流海馬氨基酸隔-海馬通路 Approach to the relationship between hippocampalamino acid levels and neuronal damage after forebrain ischemia/reperfusion in rats.Zheng Jian,Dong Weiwei,Zhao Shifu.Department of Neurology,Xinqiao Hospi

3、tal,Third Military Medical University,Chongqing 400037.AbstractObjectiveTo study the relationship between hippocampal amino acid levels and neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion.MethodsForebrain ischemia/reperfusion model was established in the rats.The contents of amino acids in the h

4、ippocampal CA1 subfield and CA3/dentate gyrus were measured.The effect of septo-hippocampal deafferentation to the hippocampal neuronal damage and amino acid levels was observed.Results1.The ischemic neuronal damage was observed only in the CA1 subfield among the hippocampal structures.The levels of

5、 Glu,Asp and GABA in CA1 subfield were not different from those in CA3ConclusionThe abnormal change of amino acid transmitter levels following cerebral ischemia is not the only factor that results in the selective vulnerability of CA1 neurons to ischemia.The neurotransmitters released from the septo

6、-hippocampal terminals during cerebral ischemia also take part in the hippocampal neuronal damage.Key wordsCerebral ischemia/reperfusionHippocampusAmino acidsSepto-hippocampal path海馬結構是腦缺血后選擇性易損部位，Kogure等1認為，腦缺血時傳入海馬的谷氨酸(Glu)能神經(jīng)末梢大量釋放的Glu對神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性，是造成海馬神經(jīng)元選擇性易損的決定因素。然而，Buchan等2研究發(fā)現(xiàn)，事先阻斷隔海馬通路(主要含乙酰

7、膽堿，acetylcholine,Ach)也可減輕海馬神經(jīng)元缺血性損害，提示該通路末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的異常活動也參與神經(jīng)元缺血性損害過程。為進一步探討腦缺血再灌流后海馬氨基酸遞質(zhì)變化與神經(jīng)元損害的關系，本研究建立大鼠前腦缺血再灌流模型，觀察了海馬CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)游離氨基酸水平變化，以及阻隔-海馬通路對海馬氨基酸水平和神經(jīng)元缺血性損害的影響。1材料和方法1.1實驗動物Wistar大鼠，雄性，230280g，共69只。本校實驗動物中心提供。1.2前腦缺血再灌流模型參照Pulsinelli等3方法，阻斷雙側椎動脈和頸總動脈血供，造成前腦缺血。20min后恢復腦血供。1.3切斷隔-海馬纖維參

8、照汪家政等4方法。固定動物于立體定位儀，開顱后用特制小刀橫向切斷左側海馬傘/穹窿。術后7d，對其中3只動物取腦冰凍切片，硫代膽堿鐵氰化鉀法做乙酰膽堿脂酶(acetylcholionesterase,AchE)染色，以確證阻斷了隔-海馬通路。1.4海馬組織游離氨基酸測定按戴光明等5方法，大鼠前腦缺血再灌流后5min、30min、1h和2h，每一時點6只動物，取腦分離海馬CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)，分別稱濕重，勻漿離心后取上清液，用氨基酸分析儀(Gold system-6300)測定氨基酸含量。6只假手術動物(除不夾閉頸總動脈外，余處理同腦缺血動物)取海馬作氨基酸測定的對照。切斷隔-海馬纖維的動物

9、，術后7d前腦缺血再灌流，再灌流后5min和30min，每一時點6只動物，取腦分離左右側海馬，分別測定氨基酸含量。6只假手術動物作對照。1.5組織學觀察6只動物前腦缺血再灌流后7d，取腦石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。6只切斷隔-海馬纖維的動物，術后7d前腦缺血再灌流，再灌流后7d取腦切片觀察，計數(shù)CA1區(qū)存活神經(jīng)元，并做左右比較。6只正常動物作對照。2結果2.1前腦缺血再灌流后海馬CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)氨基酸水平變化前腦缺血再灌流后各時點觀察，海馬Glu和天門冬氨酸(Asp)水平顯著低于對照，而-氨基丁酸(-amino butyric acid,GABA)水平顯著高于對照。海馬CA1

10、區(qū)與CA3/齒狀回區(qū)相比較，Glu、Asp和GABA水平均無顯著差異(見表1)。表1大鼠前腦缺血再灌流后海馬氨基酸含量(mol/g濕重，±s)CA1CA3/DGGluAspGABAGluAspGABA對照再灌流后5min30min1h2h8.69±0.327.62±0.35*7.52±0.28*8.05±0.12*8.11±0.20*2.20±0.161.46±0.09*1.50±0.14*1.82±0.11*1.90±0.12*1.61±0.112.76±0.18

11、*2.36±0.07*2.20±0.09*1.96±0.14*8.72±0.267.57±0.19*7.60±0.16*8.23±0.16*8.28±0.10*2.12±0.121.50±0.11*1.52±0.09*1.76±0.14*1.85±0.12*1.58±0.142.98±0.15*2.56±0.12*2.37±0.16*2.03±0.11*與假手術對照組比較*P<0.05,*P<0.01，每

12、組6只動物。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，前腦缺血20min后再灌流7d，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯損害，錐體細胞數(shù)量減少。海馬其余部位無明顯病理改變。2.2阻斷隔-海馬通路對前腦缺血再灌流后海馬神經(jīng)元損害和氨基酸水平的影響切斷左側海馬傘/穹窿后7d，對其中3只動物取腦做AchE染色，均觀察到左側海馬較右側海馬明顯淡染，僅輕度著色。表明阻斷了左側隔-海馬膽堿能通路。切斷左側海馬傘/穹窿后前腦缺血再灌流，7d后取腦切片，光鏡下見雙側海馬CA1區(qū)均有缺血性損害。左側CA1區(qū)的損害比右側明顯較輕，存活神經(jīng)數(shù)量較右側顯著多(每mm存活神經(jīng)元數(shù)： 左側89.33±10.61， 右側13.50± 2.4

13、3,成對t檢驗，P<0.01)。切斷左側海馬傘/穹窿后前腦缺血再灌流，左側與右側海馬相比較，Glu、Asp和GABA的含量均無顯著差異(見表2)。表2阻斷隔-海馬通路后海馬氨基酸含量變化(mol/g濕重，±s)假手術對照再灌流后5min再灌流后30min左側右側左側右側GluAspGABA8.98±0.362.01±0.151.59±0.147.73±0.39*1.42±0.022.71±0.218.16±0.58*1.56±0.172.70±0.269.24±1.451.82&

14、#177;0.292.31±0.068.47±0.961.71±0.092.36±0.13與假手術組對照比較*P<0.05,P<0.01,每組6只動物。注：左側為切斷海馬傘/穹窿側。3討論盡管早就發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌流后海馬結構中CA1區(qū)神經(jīng)元更易發(fā)生損害，卻缺乏海馬結構不同亞區(qū)氨基酸遞質(zhì)變化的比較研究報道。本實驗觀察到，大鼠前腦缺血再灌流后，海馬CA1區(qū)和CA3/齒狀回區(qū)氨基酸水平發(fā)生顯著變化，但在再灌流后各時點的觀察均未發(fā)現(xiàn)CA1區(qū)與CA3/齒狀回區(qū)的Glu、Asp和GABA水平的變化存在差異。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，海馬結構中僅CA1區(qū)發(fā)生明顯損害

15、，其余部位(包括CA3/齒狀回區(qū))相對完整。上述結果表明，腦缺血再灌流后海馬CA1區(qū)的選擇性易損害與氨基酸遞質(zhì)水平變化有關外，尚有其它因素參與。本實驗發(fā)現(xiàn)，事先阻斷隔-海馬通路可明顯減輕海馬神經(jīng)元缺血性損害，但對海馬Glu、Asp和GABA水平的變化無影響。表明阻斷隔-海馬通路后減輕海馬神經(jīng)元缺血性損害的作用不是通過影響海馬氨基酸遞質(zhì)水平實現(xiàn)的。隔-海馬通路主要含Ach能纖維。Kumagae等6觀察到大鼠前腦缺血再灌流后海馬細胞外液Ach濃度明顯升高。我們以往也發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌流后海馬結構AchE活性發(fā)生變化，尤以CA1區(qū)的改變最明顯5，Ach能M受體拮抗劑阿托品可減輕海馬神經(jīng)元缺血性損害7。

16、結合上述研究結果，可認為腦缺血再灌流期間隔-海馬通路末梢大量釋放的Ach是造成海馬神經(jīng)元選擇性易損的重要因素之一，確切的機制有待進一步闡明。作者單位：鄭健趙士福400037重慶第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科董為偉重慶醫(yī)科大學神經(jīng)病研究所參考文獻1 Kogure K.The mechanism of ischemia-induced brain cell injury:the membrance theory.Neurochemical pathology,1988,9:145.2 Buchan AM,Pulsinelli WA.Septo-hippocampal deafferentation protects CA1 neurons against ischemic injury.Brain Res,1990,512:7.3 Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979,10:267.4 汪家政，柳川，華仲慰，等.大鼠隔-海馬通路損傷對海馬內(nèi)遞質(zhì)含量及酶活力的影響.生理學報，1990，42：289.5 戴光明，鄭健，張基謨，等.腦缺血/再灌注后大鼠海馬GABA、AchE水平和遲發(fā)性