扶正利濕活血復(fù)方對(duì)鴨胚肝細(xì)胞中鴨乙型肝炎病毒的抑制作用

1、扶正利濕活血復(fù)方對(duì)鴨胚肝細(xì)胞中鴨乙型肝炎病毒的抑制作用         【摘要】  目的探討扶正利濕活血中藥復(fù)方水提物和醇提物對(duì)先天感染乙肝病毒（HBV）的鴨胚肝細(xì)胞乙型肝炎病毒（DHBV）的抑制作用。方法熒光定量PCR技術(shù)對(duì)鴨胚尿囊液DHBV DNA分析篩選先天感染DHBV的陽性鴨胚，對(duì)DHBV陽性的鴨胚肝細(xì)胞原代培養(yǎng)；細(xì)胞接種后第3天分組加入不同劑量扶正利濕活血復(fù)方水提物和醇提物，共6 d，分別于藥物干預(yù)前、藥物干預(yù)第3天、第6天、停藥第2天收集培養(yǎng)上清；辛酸鈉法提取上清DHBV DNA，實(shí)時(shí)熒光定量

2、PCR（FQ-PCR）檢測(cè)分析血清DHBV DNA的含量。結(jié)果水提物各劑量組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)DHBV DNA載量相比無顯著性差異（P0.05），僅水提物低劑量組DHBV DNA載量顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)病毒對(duì)照組（P0.05）；醇提物中、低劑量組在給藥后和停藥后培養(yǎng)上清DHBV均明顯下降（組間、組內(nèi)比較均為P0.01），扶正利濕活血復(fù)方醇提物高劑量組在給藥后第3天時(shí)DHBV明顯下降（組間、組內(nèi)比較均為P0.01），第6天時(shí)組內(nèi)比較無明顯下降（P0.05），而在停藥后第3天時(shí)組內(nèi)與組間比較又均有顯著性差異（均為P0.01）。結(jié)論扶正利濕活血復(fù)方醇提物對(duì)鴨胚肝細(xì)胞中的DHBV有直接抑制作用，水提物在鴨體

3、內(nèi)可能不是通過直接抑制DHBV而起作用。 【關(guān)鍵詞】  扶正利濕活血；鴨乙型肝炎病毒；肝細(xì)胞； 熒光定量PCRAbstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of Chinese medicine compound prescriptions Fuzheng Lishi Huoxue on duck hepatitis B virus (DHBV) in duck embryo liver Cells. MethodsThe duck embryo liver cells with congenital infection DHBV

4、were incubated with different concentration extracts of Chinese medicine compound Fuzheng Lishi Huoxue, which was extracted with water and alcohol respectively. The level of DHBV DNA in culture supernatants was detected using FQ-PCR at different time points after the cell being inoculated. ResultsWa

5、ter extract of Fuzheng Lishi Huoxue had no significant effect on supernantant DHBV DNA Content  (P0.05), but alcohol extract of Fuzheng Lishi Huoxue supernatant DHBV DNA content (P0.01).ConclusionThe alcohol extract of Chinese medicine Compound Fuzheng Lishi Huoxue has direct inhibitory effect

6、on duck hepatitis B virus (DHBV) in duck embryo liver cells.Key words:Compound Fuzheng Lishi Huoxue;  Duck Hepatitis B virus (DHBV);  Liver Cell;  FQ-PCR   乙型病毒性肝炎是當(dāng)今世界上3大頑癥之一,全世界范圍內(nèi)大約有4億乙型肝炎病毒(HBV) 感染者1，我國(guó)一般人群中HBsAg流行率為9.09% ,估計(jì)約1.1億人為慢性HBV 感染,占全世界慢性HBV感染者的1/32。乙型肝炎抗病毒治療的目標(biāo)

7、是持續(xù)抑制HBV復(fù)制、清除病毒,阻止肝臟炎癥和壞死的進(jìn)展,使疾病獲得痊愈3。由于HBV 復(fù)制的原始模板cccDNA 難以消除,加之患者存在不同程度對(duì)HBV 的免疫耐受, 使得目前的治療藥物要達(dá)到徹底清除病毒是非常困難的，如核苷類似物抗HBV 作用強(qiáng)而快,但療程難以確定,長(zhǎng)期治療均可產(chǎn)生耐藥突變,在治療過程中會(huì)引起ALT和HBV DNA的突破,可使病情惡化4。   中醫(yī)藥具有抑制HBV復(fù)制、抗肝纖維化、改善肝功能、保護(hù)肝細(xì)胞等作用,在治療乙型病毒性肝炎方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥復(fù)方是中醫(yī)防治疾病的特殊手段，最能體現(xiàn)中醫(yī)理論的精髓，是治療乙型病毒性肝炎的有效手段。本研究基于乙型病毒

8、性肝炎多為濕熱疫毒侵襲、肝脾腎虛損、瘀血阻絡(luò)，終致氣血、陰陽紊亂，臟腑功能出現(xiàn)虛損性和失調(diào)性變化的病機(jī)特點(diǎn)，以扶正利濕活血為法，研究中藥復(fù)方水提物和醇提物對(duì)先天感染的鴨胚肝細(xì)胞DHBV的抑制作用，以期初步探索中藥扶正利濕活血復(fù)方治療鴨慢性乙型肝炎的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。1  材料和方法1  試劑和中藥復(fù)方提取物制備孵化2225日齡的鴨胚，自市場(chǎng)上購(gòu)買。Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司；LA TaqDNA 聚合酶、dNTP (A、T、C、G 4 種堿基, 25 mmol/ L)，分子量Marker均購(gòu)自Ferments 公司；青霉素、鏈霉素為上海先鋒藥業(yè)公司產(chǎn)品；Will

9、iams E培養(yǎng)基、膠原蛋白酶購(gòu)自Sigma公司；PCR master Mix購(gòu)自TOYOBO公司；PCR試劑膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。ABI7300型熒光定量PCR儀，水平電泳設(shè)備。   扶正利濕活血中藥復(fù)方主要含旱連草、女貞子、山藥、炙甘草、益母草、白花蛇舌草、丹參等，各成分購(gòu)自廣州采芝林醫(yī)藥連鎖店，水提物制備用水煎煮2次，合并提取液后加熱濃縮至1 g/ml，儲(chǔ)存于20備用。醇提物用無乙醇浸泡，按處方比例稱取藥材250 g，加入無水乙醇800 ml，密封常溫浸泡24 h后收集浸泡液；然后再如此法浸泡一次，合并浸泡液，減壓濃縮至1 g/

10、ml，儲(chǔ)存于20備用。2 先天感染DHBV陽性篩選將留取的尿囊液提取DNA，提取液組成：0.2 mol/L NaOH，1%（W/V）SDS；取20 l尿囊液，加入60 l提取液，混勻后室溫放置10 min；再加入80 l異丙醇，混勻后4，13 000 r/min離心7 min，棄上清，再加入40異丙醇10 000 r/min，5 min洗1次，然后用20 l去離子水溶解沉淀。用PCR法檢測(cè)DHBV，PCR引物為：gatccactcctgggaaacaa-DS1；cagacagcgtggctaattga-DS2。擴(kuò)增產(chǎn)物為589 bp；條件為：94預(yù)變性4 min，然后94，30 s，55，30

11、 s，72，1 min。進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后再72延伸5 min。3 鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)打開鴨胚后收集尿囊液留作篩選DHBV先天陽性鴨胚，篩選方法如前述。然后切取整個(gè)肝臟，用Hanks洗滌并剪碎，然后置于含有0.2膠原酶II的培養(yǎng)基中于4消化過夜。培養(yǎng)基采用William E培養(yǎng)基，并添加輔助成分，其輔助成分及濃度分別為：L-谷氨酰氨2 mM，HEPES15 mM，胰島素1 g/ml，青霉素100 U/ml，鏈霉素33 g/ml，氫化可的松105M，二甲基亞砜1.5，調(diào)pH至7.2。消化完后，每只鴨胚肝臟細(xì)胞用5 ml培養(yǎng)基洗滌兩次，加入24 ml培養(yǎng)基，吹打混勻后，加入24孔板中，每孔1 ml。

12、貼壁3 h后換液，以后每天換液1次。4 藥物作用在細(xì)胞接種后第3天開始上藥，扶正利濕活血復(fù)方水提物和醇提物，均為3個(gè)濃度，分別為10，1，0.1 mg/ml。以拉米夫定作為陽性對(duì)照藥，其濃度為1 mmol/ml。上藥6 d，分別在藥物干預(yù)前（D0）、第3天（D3）、第6天（D6）、停藥第2天（P2）收集培養(yǎng)上清液，保存于70待檢。5 DHBV熒光定量檢測(cè)方法DHBV DNA提取用辛酸鈉法，40 l培養(yǎng)上清液中加入120 mmol/L辛酸鈉20 l，99加熱10 min，14 000 r/min離心10 min，取2 l上清進(jìn)行檢測(cè)。FQ-PCR檢測(cè)方法：以插入了DHBVS基因片段nt1251-

13、1773的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍稀釋做標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)品序列中設(shè)計(jì)TaqMan引物探針，序列為，sense primer：CAGGCTTGCTGTATCTGACGG；antisense primer： GGCAGTAGTGAAGAGATGGAGGA  ； Probe： FAM- CTGAGACCGACGCCCATTGGAGCTTTTAMRA。用TOYOBO公司的realtime PCR masterMix為PCR試劑，采用25 l反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95預(yù)變性1 min；95變性15 s；60退貨延伸1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法PCR反應(yīng)完畢用軟件分析計(jì)算后，對(duì)樣品的

14、每個(gè)結(jié)果乘以1.5，即得出樣品的實(shí)際DHBV拷貝數(shù)。計(jì)量資料以±s表示,治療前后比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn),組間比較采用方差分析, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為0.05，采用SPSS1010統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。         2  結(jié)果2.1  扶正利濕活血復(fù)方水提物對(duì)鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)上清DHBV載量的影響扶正利濕活血復(fù)方水提物各劑量組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)DHBV DNA載量相比無顯著性差異（P0.05），僅水提物低劑量組DHBV DNA載量顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)病毒對(duì)照組（P0.05）；拉米夫定組在給藥后第3、6天

15、及停藥后第3天與開始給藥時(shí)（D0）有顯著降低（均為P0.01）。因此扶正利濕活血復(fù)方水提物組對(duì)先天感染鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的DHBV無明顯抑制作用。見表1。表1  扶正利濕活血復(fù)方水提物對(duì)鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)上清DHBV載量的影響（略）2.2 扶正利濕活血復(fù)方醇提物對(duì)鴨胚肝細(xì)胞培養(yǎng)上清DHBV載量的影響表2顯示，拉米夫定在給藥及停藥后培養(yǎng)上清中的DHBV載量都明顯降低（組間、組內(nèi)比較均為P0.01）；扶正利濕活血復(fù)方醇提物高劑量組在給藥后第3天（D3）時(shí)DHBV明顯下降（組間、組內(nèi)比較均為P0.01），而到給藥后第6天時(shí)組內(nèi)比較無明顯下降（P0.05），而在停藥后第3天（P2）時(shí)組內(nèi)與組

16、間比較又均有顯著性差異（均為P0.01），所以扶正利濕活血復(fù)方醇提物高劑量組可能對(duì)培養(yǎng)上清中的DHBV有抑制作用，但還需要   目前，應(yīng)用于HBV相關(guān)研究的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括能夠直接感染乙肝類病毒的HepaRG細(xì)胞系5、DHBV感染原代鴨肝細(xì)胞及不能直接感染的肝癌細(xì)胞系。肝癌細(xì)胞系不能直接感染病毒6，只能通過基因轉(zhuǎn)染而復(fù)制子代病毒，該類細(xì)胞中沒有HBV自然感染中必有的復(fù)制模板：cccDNA。而DHBV在鴨肝細(xì)胞中復(fù)制具有所有的復(fù)制中間體，因此鴨胚肝細(xì)胞在HBV感染機(jī)理研究、抗HBV藥效等研究中得到廣泛應(yīng)用。   乙型肝炎抗病毒治療的目標(biāo)是持續(xù)抑制HBV

17、復(fù)制,以減輕和防止肝臟病變加重和復(fù)發(fā),減緩和防止進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌。然而從治療策略上看,最終的治療目標(biāo)應(yīng)該是清除病毒,阻止肝臟炎癥和壞死的進(jìn)展,使疾病獲得痊愈3。在臨床中最常用的抗HBV西藥有兩類，即核苷類似物和干擾素類。干擾素也具有一定的抗HBV作用，但臨床中真正適宜于干擾素治療的患者并不多，且已有研究表明，在應(yīng)用干擾素治療過程中，患者血清中往往出現(xiàn)干擾素抗體7，其近期療效中血清HBeAg 和HBV DNA 陰轉(zhuǎn)率僅為40 %左右8，所以干擾素也不能清除HBV，停藥后也可出現(xiàn)HBV反跳且由于一定的不良反應(yīng)及價(jià)格昂貴而使臨床應(yīng)用受限。所以，這二類藥物并不是理想的抗HBV藥物，且這二

18、者價(jià)格昂貴，所以到目前為止，人們?nèi)匀辉谂ふ腋m宜的抗HBV藥物。   拉米夫定(lamivudine,LMD 或3TC)為雙脫氧核苷類似物,是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。拉米夫定最初用于治療HIV感染,以后發(fā)現(xiàn)對(duì)于HBV復(fù)制具有抑制作用9。拉米夫定抗HBV作用表現(xiàn)在:抑制血清HBV DNA；使血清ALT恢復(fù)并保持正常；阻止肝臟纖維化的進(jìn)展；促進(jìn)HBeAg的血清轉(zhuǎn)換,即HBeAg轉(zhuǎn)陰,抗-HBe轉(zhuǎn)陽。  但拉米夫定治療乙型肝炎有兩大缺陷，一是隨著拉米夫定治療時(shí)間的延長(zhǎng),檢測(cè)到HBV酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)變異株(在嗜肝DNA病毒屬的DNA聚合酶中存在Y

19、MDD)保守區(qū)域，這一區(qū)域的變異通常導(dǎo)致抗拉米夫定病毒株的形成10；二是肝炎治療停藥后出現(xiàn)ALT反跳,病情惡化。 中藥復(fù)方是中醫(yī)防治疾病的特殊手段，最能體現(xiàn)中醫(yī)理論的精髓，在治療慢性肝炎及抗HBV病毒方面有著潛在優(yōu)勢(shì)。乙型病毒性肝炎病機(jī)雖錯(cuò)綜復(fù)雜，但濕熱疫毒侵襲、肝脾腎虛損、瘀血阻絡(luò)，終致氣血、陰陽紊亂，臟腑功能出現(xiàn)虛損性和失調(diào)性變化是其主要病機(jī)特點(diǎn)。因此，本研究以扶正利濕活血為法，研究中藥復(fù)方水提物和醇提物對(duì)先天感染的鴨胚肝細(xì)胞DHBV的抑制作用。從結(jié)果來看，扶正利濕活血復(fù)方水提物各劑量組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)DHBV DNA載量相比無顯著性差異（P0.05），僅水提物低劑量組DHBV D

20、NA載量顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)病毒對(duì)照組（P0.05）；拉米夫定組在給藥后第3、6天及停藥后第3天與開始給藥時(shí)（D0）有顯著降低（均為P0.01），表明扶正利濕活血復(fù)方水提物在鴨體內(nèi)可能不是通過直接抑制DHBV而起作用。   扶正利濕活血復(fù)方醇提物中、低劑量組在給藥后和停藥后培養(yǎng)上清DHBV均明顯下降（組間、組內(nèi)比較均為P0.01），這說明扶正利濕活血復(fù)方中、低劑量組均可顯著抑制培養(yǎng)上清中的DHBV。扶正利濕活血復(fù)方醇提物高劑量組在給藥后第3天（D3）時(shí)DHBV明顯下降（組間、組內(nèi)比較均為P0.01），而到給藥后第6天時(shí)組內(nèi)比較無明顯下降（P0.05），而在停藥后第3天（P2）

21、時(shí)組內(nèi)與組間比較又均有顯著性差異（均為P0.01），所以扶正利濕活血復(fù)方醇提物高劑量組可能對(duì)培養(yǎng)上清中的DHBV有抑制作用。醇提物中的成分不同于水提物，其中可能含有直接抑制DHBV作用的物質(zhì)，但還需進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Zoulim F.Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide analogs in chronic hepatitis B virus infectionJ.Antiviral Res,2004 ,64:1.2秦成勇，韓國(guó)慶.我國(guó)乙型肝炎的發(fā)病現(xiàn)狀及治療進(jìn)展J.醫(yī)學(xué)研究雜志, 2007，36（1）:22.3Yuen MF, Wang KH, Sablon E, et al. HBsAg seroclearance in chronic hepatitis B in the Chinese : virological , histological ,and clinical aspect sJ.Hepatology ,2004 ,39 :1694.4斯崇文. 對(duì)當(dāng)前慢性乙型肝炎抗病毒治療的看法J.中華傳染病雜志, 2005，23(2):73.5Gripon P, Rumin S, urban