腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工程細胞腦內移植治療帕金森病大鼠的實驗研究

1、    腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工程細胞腦內 移植治療帕金森病大鼠的實驗研究        【摘要】目的觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）基因工程成肌細胞腦內紋狀體移植對帕金森病大鼠的治療作用。方法建立逆轉錄病毒介導的BDNF表達質粒并轉染成肌細胞，篩選陽性細胞進行腦內移植。結果基因工程成肌細胞腦內移植可明顯提高帕金森病大鼠黑質酪氨酸羥化酶（TH）陽性神經(jīng)元的存活率，使紋狀體多巴胺含量明顯增加，動物的旋轉行為改善約50%，并持續(xù)2個月之久。結論腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因工

2、程成肌細胞腦內紋狀體移植可明顯改善動物的旋轉行為并可促進黑質神經(jīng)原的存活，為帕金森病的治療提供了一種新的有效的治療方法?！娟P鍵詞】帕金森病腦源性神經(jīng)生長因子基因療法Grafting myoblasts genetically engineered to produce BDNF in rats Parkinson disease modelsQU Shen, HE Xiaolong, HE Cheng, et al. Department of Neurobiology, The Second Military Medical University, Shanghai 200433.【Abst

3、ract】ObjectiveTo observe the role of genetically engineered myoblast in the treatment of rat Parkinson disease models. Methods Genetically modified myoblasts to produce brain derived neurotrophic factors (BDNF) were established and grafted into the corpora striata of Parkinson disease modelsin rats.

4、 The behavior and pathological changes were observed and the Dopamine contents in the corbora striata were measured with high performance liquid chromatography (HPLC). ResultsThe intracranial graft of genetically engineered myoblasts can promote the survival of TH-positive neurons in the nigra of Pa

5、rkinson's rat and the content of Dopamine in the striatum were increased significantly. The rotation behavior improved 50% after the transplantation. Conclusion It is suggested that BDNF secreting myoblasts can promote the survival of the neuron and provide a new and effective method for the tre

6、atment of Parkinson disease. 【Key words】Brain-derived neurotrophic factor Parkinson disease Gene therapy 帕金森病(PD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴重影響到患者的健康和生存能力，主要表現(xiàn)為黑質多巴胺能神經(jīng)元的喪失，紋狀體多巴胺含量嚴重下降，臨床上以震顫、強直、運動遲緩為主要表現(xiàn)。至今尚無有效的藥物能阻止神經(jīng)元的變性，使病情逆轉。腦源性神經(jīng)生長因子能特異性的促進腦內多巴胺能神經(jīng)元的存活，保護神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性的作用，為帕金森病的治療帶來了希望。血腦屏障的存在使常規(guī)的給藥方式受到了限制，而帕金

7、森病緩慢進展的病情又需要反復長期給藥，基因治療的出現(xiàn)為此提供了可能，本研究擬通過腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因工程細胞腦內移植在腦內緩慢釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，在帕金森病大鼠中起到治療作用。 材料和方法一、BDNF基因工程細胞的構建與篩選將EcoR1酶切下的BDNFcDNA經(jīng)酶切，補平，去磷酸化，平端連接于雙拷貝逆轉錄病毒載體PN2A，電泳，酶切鑒定為正向連接，電穿孔法轉染PA317包裝細胞，根據(jù)其攜帶的neo基因采用G418篩選轉染陽性克隆，選取高滴度的病毒上清感染成肌細胞L-6TG，G418 400 g/ml約2周后篩選出陽性細胞株，命名為BDNF（+）/L-6TG細胞。二、BDNF（+）/

8、L-6TG細胞BDNFmRNA的表達及生物學活性測定采用地高辛標記BDNF探針Northern雜交證實轉基因細胞內有BDNFmRNA的表達，且基因工程細胞分泌上清能促進PC12突起生長和細胞存活，證實其具BDNF的體外生物學活性。三、6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損制備PD大鼠模型參照Ungerstedt1等方法，雄性SD大鼠200220 g，2%戊巴比妥鈉麻醉后黑質致密區(qū)定位注射（前囟后5.0 mm,旁開2.0 mm,硬膜下7.5 mm），微量注射器緩慢注入6-OHDA，每只4 l（2 g/l），3天后阿樸嗎啡腹腔內注射誘導大鼠的旋轉行為，選取>10轉/分鐘的大鼠為PD模型成功大鼠，

9、120只大鼠中共制備得32只PD模型，實驗組和對照組各13只，PD組6只，分別于1周后行細胞移植。四、基因工程細胞腦內移植培養(yǎng)幾近融合細胞，胰酶消化后懸浮于磷酸緩沖液(PBS)中，細胞計數(shù)后進行紋狀體移植（前囟前1.0 mm,旁開2.5 mm,硬膜下4.5 mm），每只4 l，細胞濃度104/l，對照組為L-6TG細胞腦內移植。五、療效觀察1.行為學觀察：細胞移植后2、4、8周進行阿樸嗎啡誘導，觀察動物的旋轉行為。2.形態(tài)學觀察：對各期動物進行腦內灌注，多聚甲醛固定，冰凍切片，片厚15 m，每個標本同一平面順切4張切片進行黑質尼氏染色和TH免疫組化染色，用中科院通用顆粒分析系統(tǒng)軟件對尼氏染色和

10、酪氨酸染色陽性神經(jīng)原進行計數(shù)和面積測定。3.腦內紋狀體多巴胺含量測定：不同階段實驗大鼠斷頭取腦，冰上分離紋狀體，置-70冰箱待測。測定時稱重勻漿，應用高壓液相電化學檢測器進行多巴胺含量測定。色譜條件：色譜柱25.0 cm、4.6 mm,顆粒度5。流動相：NaH2PO42H2結果討論帕金森病基因治療的研究目前主要集中在兩個方面：一個是以補充多巴胺的不足為目的，即先前的多巴胺和酪氨酸羥化酶（TH）的轉基因治療，TH是多巴胺合成中的限速酶，與腦內多巴胺含量有明顯關系。國外Wolff等2和國內趙迎春等3進行了TH基因工程細胞大鼠紋狀體腦內移植的研究，發(fā)現(xiàn)可改善動物的旋轉行為，TH陽性細胞存活增加，并可

11、持續(xù)表達至數(shù)月之久。這些結果都表明TH基因腦內移植對帕金森病有治療作用。另一種方法是以挽救幸存神經(jīng)原為目的的基因治療，即神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療研究。近年來，BDNF對多巴胺神經(jīng)元的特異性作用引起了人們的關注，其體內外作用已得到了深入的研究4，5，體內BDNF對多巴胺神經(jīng)元的保護作用已有大量證據(jù)，而其治療作用卻鮮有報道。David等6將BDNF基因工程成纖維細胞提前移植于1-甲基-4-苯-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)毀損的帕金森大鼠紋狀體，可防治1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)對大鼠的毒性作用，黑質TH陽性細胞較之對照組明顯增加，說明其具有保護黑質多巴胺能神經(jīng)元的作用，這可能是通過逆軸突

12、轉運誘導細胞的保護機制或增加線粒體的功能發(fā)揮作用。本研究選擇了6-OHDA特異性毀損黑質多巴胺能神經(jīng)元制備帕金森癥動物模型來研究BDNF對帕金森癥的治療作用。結果發(fā)現(xiàn)，在給予細胞移植后，動物的旋轉行為明顯減少并持續(xù)了2個月之久，與對照組相比，相差非常顯著，個別動物旋轉行為完全消失。毀損側紋狀體多巴胺含量與對照組相比亦有明顯升高，分別為50%與16%，與David等研究相吻合。同時我們對不同治療階段鼠腦冰凍切片，進行尼氏染色和TH免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)毀損側黑質尼氏染色和酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元與對側相比均顯著減少，移植組細胞存活數(shù)和存活率與對照組、PD組相比均明顯增加，在各期均相差非常顯著。這些研究

13、結果顯示，BDNF基因工程成肌細胞腦內移植可明顯促進黑質多巴胺能神經(jīng)元的存活，阻止紋狀體多巴胺含量的降低，改善動物的旋轉行為，對帕金森病的治療有一定效果。目前認為，帕金森病的治療從根本上解決問題應當是阻止和減緩神經(jīng)元的變性和死亡，先期采用的左旋多巴和TH的治療主要為一種補償性治療，不能從根本上挽救神經(jīng)元的變性和死亡，需長期表達和分泌維持治療效果，而BDNF可以阻止和減輕神經(jīng)元的變性和喪失，延緩緩慢進展的帕金森病程，因此，不失為一有效的治療方法，如TH和BDNF聯(lián)合應用則更有效和理想7。國外采用神經(jīng)生長因子和嗜鉻細胞的共同移植已取得了一定效果8。作者單位：200433 上海，第二軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學

14、部神經(jīng)生物教研室(曲伸系研究生，現(xiàn)在長海醫(yī)院內分泌科)參考文獻1Ungerstedt U.Postsynaptic super sensitivity after 6-Hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal copamine system. Acta Phys， 1971，367(Suppl):69-90.2Wolff JA, Fisher LJ, Xu Li， et al. Crafting fibroblasts genetically modified to produce L-dopa in a model

15、of Parkinson disease. Proc Natl Acad. Sci USA， 1989，86:9011-9014.3趙迎春，陳生弟，劉振國,等.酪氨酸羥化酶基因工程細胞植入大鼠紋狀體的研究. 中華醫(yī)學雜志，1996；76：52-53.4Wiegand S, Alexander C, Lindsay R, et al. Axonal transport of 125I-labeled neurotrophins in the central nervous system. Soc Neurosci Abstr, 1991,17:1121-1125.5Matin M,Todd K,

16、 Altar C, et al.Behavioral and in vivo neurochemical effects of the neurotrophic factors BDNF and NT-3 and their interaction with amphetamine. J Neurosci, 1994,14:1262-1270.6David M, Tara A, Wendy R， et al. Implanted fibroblasts genetically engineered to produce BDNF prevent MPTP toxicity to dopaminergic neurons in the rat. Proc Natl Acad Sci USA， 1994，91:5104-5108.7Kupsch A, Oertel W, Earl C， et al. Neuronal transplantation and neurotrophic factors in the treatment of parkinson desease, up date February 1995.J