基因工程的基本操作程序

1、Company LogoCompany LogoAdd Your Company Slogan選修三選修三 第第 1 1 專(zhuān)題專(zhuān)題基基 因因 工工 程程Company Logo基因工程基因工程原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編編 碼碼 區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（能夠轉(zhuǎn)錄（能夠轉(zhuǎn)錄mRNA，能夠編碼蛋白質(zhì)），能夠編碼蛋白質(zhì)）（不能轉(zhuǎn)錄（不能轉(zhuǎn)錄mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)），不能編碼蛋白質(zhì)）啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子位置位置功能功能(編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游)( (引導(dǎo)引導(dǎo)RNARNA聚合酶的正確結(jié)合聚合酶的正確結(jié)合) )位置位置功能功能( (編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游)

2、 )( (阻礙阻礙RNARNA聚合酶移動(dòng)并使其脫離聚合酶移動(dòng)并使其脫離 ) )Company Logo基因工程基因工程真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子編編 碼碼 區(qū)區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)（間隔的、不連續(xù)的）（間隔的、不連續(xù)的）（不能轉(zhuǎn)錄（不能轉(zhuǎn)錄mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段），不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段）啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子位置位置功能功能位置位置功能功能外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子（編碼區(qū)中能夠編碼蛋白質(zhì)的序列）（編碼區(qū)中能夠編碼蛋白質(zhì)的序列） （編碼區(qū)中不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列（編碼區(qū)中不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列 ）Company Lo

3、go基因工程基因工程原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同不同相同相同編碼區(qū)連續(xù)編碼區(qū)連續(xù)編碼區(qū)間隔、不連續(xù)編碼區(qū)間隔、不連續(xù)能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)+ +具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)啟動(dòng)子與起始密碼啟動(dòng)子與起始密碼終止子與終止密碼終止子與終止密碼Company Logo原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄基因工程基因工程轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄mRNAmRNA翻翻 譯譯多肽多肽蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Company Logo真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄基因工程基因工程轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄前體前體mRNAmRNA翻翻 譯譯多肽多肽蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)成熟成熟mRNAmRNACompany Log

4、o基因工程基因工程Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取目的基因目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。主要是指主要是指編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì)的基因的基因。1 1、概念、概念從自然界已有物種中分離：從自然界已有物種中分離： 鳥(niǎo)槍法鳥(niǎo)槍法人工合成基因：人工合成基因：反轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法2 2、方法、方法從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程

5、的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(1) (1) 鳥(niǎo)槍法鳥(niǎo)槍法限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割切割供體細(xì)胞的供體細(xì)胞的DNADNA成許多片段成許多片段運(yùn)載體運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞供體細(xì)胞的供體細(xì)胞的DNADNA所有片段分別大量復(fù)制所有片段分別大量復(fù)制找出含目的基因的細(xì)胞，找出含目的基因的細(xì)胞，再分離相應(yīng)再分離相應(yīng)DNADNA片段片段應(yīng)用應(yīng)用散彈射擊法散彈射擊法Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(2) (2) 反

6、轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法目的基因目的基因的的mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶RNADNARNADNA的雜合雙鏈的雜合雙鏈核酸酶核酸酶HH單鏈的單鏈的DNADNA( (cDNAcDNA) )DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈的雙鏈的DNADNA( (目的基因目的基因) )Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(3) (3) 化學(xué)合成法化學(xué)合成法根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)推測(cè)推測(cè)目的基因

7、目的基因化學(xué)合成化學(xué)合成Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序DNADNA合成儀合成儀Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(4) (4) 從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取基因文庫(kù)基因文庫(kù)(gene library)(gene library)：將含有某種生物不同基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多的許多DNADNA片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因。受體

8、菌分別含有這種生物的不同的基因?；蛭膸?kù)基因文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)：包含一種生物的：包含一種生物的所有所有基因基因：包含一種生物的：包含一種生物的部分部分基因基因cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(4) (4) 從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取 基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建全部基因：編碼區(qū)和非編碼區(qū)全部基因：編碼區(qū)和非編碼區(qū)鳥(niǎo)槍法鳥(niǎo)槍法 cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法部分基因：外顯子部分基因：外顯子

9、( (真核真核) )、編碼區(qū)、編碼區(qū)( (原核原核) )得到的得到的cDNAcDNA + + 運(yùn)載體運(yùn)載體 受體細(xì)胞受體細(xì)胞Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(4) (4) 從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取依據(jù)目的基因的有關(guān)信息獲取目的基因依據(jù)目的基因的有關(guān)信息獲取目的基因Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(5) (5) 利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增

10、 概念：概念：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在生物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在生物體外復(fù)制特定體外復(fù)制特定 DNA DNA片段片段的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。 原理：原理：DNADNA半保留復(fù)制。半保留復(fù)制。Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(5) (5) 利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增 方式：方式： 原料：原料： 4 4種脫氧核苷酸、種脫氧核苷酸、 TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶以以2 2n n指數(shù)指數(shù)方式擴(kuò)增方式擴(kuò)增(n(n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)) ) 結(jié)果：結(jié)果：短時(shí)

11、間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因 條件：條件：一段已知目的基因的核苷酸序列；引物。一段已知目的基因的核苷酸序列；引物。Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取2 2、方法、方法(5) (5) 利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增 過(guò)程：過(guò)程：a. a. 變性變性(90-95)(90-95)：雙鏈：雙鏈DNADNA模板在模板在高溫高溫作用作用下，下，氫鍵斷裂氫鍵斷裂，形成，形成單鏈單鏈DNA

12、DNA。b. b. 退火退火( (復(fù)性復(fù)性55-60)55-60)：系統(tǒng)：系統(tǒng)溫度降低溫度降低，引物，引物與與DNADNA模板結(jié)合，形成模板結(jié)合，形成局局部雙鏈部雙鏈。 c. c. 延伸延伸(70-75)(70-75)：在：在TaqTaq酶的作用下，合成酶的作用下，合成與模板與模板互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNADNA鏈鏈。 Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.已知核苷酸序列，基已知核苷酸序列，基因較小因較小a.a.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取條件條件方法方法2.2.已知核苷酸序列或部已知核苷酸序列或部分序列，基因較大分序列，基因較

13、大3.3.核苷酸序列未知，無(wú)核苷酸序列未知，無(wú)mRNAmRNA4.4.已知相關(guān)基因?qū)?yīng)的已知相關(guān)基因?qū)?yīng)的mRNAmRNAb.b.從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取或或PCRPCRc.c.從從cDNAcDNA文庫(kù)中獲取文庫(kù)中獲取或逆轉(zhuǎn)錄后或逆轉(zhuǎn)錄后PCRPCRd.d.人工直接合成人工直接合成Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1 1、目的、目的 核心核心使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代；同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。下一

14、代；同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2 2、組成、組成目的基因目的基因+復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+終止子終止子+標(biāo)記基因標(biāo)記基因強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子動(dòng)物目的基因不能用于轉(zhuǎn)基因植物動(dòng)物目的基因不能用于轉(zhuǎn)基因植物( (內(nèi)含子內(nèi)含子) )基因產(chǎn)物是糖蛋白的基因在原核生物中不表達(dá)基因產(chǎn)物是糖蛋白的基因在原核生物中不表達(dá) Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、構(gòu)建、構(gòu)建 核心核心不不同同來(lái)來(lái)源源的的基基因因重重組組Company Logo基因工程基因工

15、程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。定和表達(dá)的過(guò)程。1 1、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化2 2、方法、方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法CaCa2+2+轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因

16、導(dǎo)入受體細(xì)胞2 2、方法、方法(1) (1) 導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物和裸子植物適用于雙子葉植物和裸子植物TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體的可轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體的DNADNA上上Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2 2、方法、方法(1) (1) 導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞 基因槍法基因槍法適用于單子葉植物適用于單子葉植物 花粉管通道法花粉管通道法開(kāi)花植物開(kāi)花植物Company Logo基因工程基

17、因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2 2、方法、方法(2) (2) 導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純?nèi)∈芫讶∈芫扬@微注射顯微注射受精卵培養(yǎng)受精卵培養(yǎng)移植至移植至雌性動(dòng)物雌性動(dòng)物新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物(3) (3) 導(dǎo)入微生物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞 CaCa2+2+轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法a. a. 用用CaCa2+2+增大細(xì)胞壁通透性增大細(xì)胞壁通透性感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞b. b. 表達(dá)載體表達(dá)載體 + + 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNADNAComp

18、any Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1 1、檢測(cè)（分子水平）、檢測(cè)（分子水平）是否插入目的基因是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄出是否轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA是否翻譯成蛋白質(zhì)是否翻譯成蛋白質(zhì)DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗原抗體雜交抗體雜交2 2、鑒定（個(gè)體水平）、鑒定（個(gè)體水平）抗性鑒定抗性鑒定功能活性鑒定功能活性鑒定Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1 1、檢測(cè)、檢測(cè) DNA DNA分子雜交分子雜交轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因生物生物限制酶限制酶片段片段電電泳泳條帶條帶堿變性堿變性轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印濾膜濾膜烘烘干干樣品樣品目的基因目的基因放射性同位素放射性同位素一段單鏈一段單鏈形成形成基因探針基因探針檢測(cè)樣品檢測(cè)樣品基因探針基因探針雜交雜交雜交條帶雜交條帶放射自顯影放射自顯影觀察觀察基因組基因組DNADNA提提取取Company Logo基因工程基因工程1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1 1、檢測(cè)、檢測(cè) 分子雜交分子雜交mRNAmRNA電泳電泳條