創(chuàng)新性實驗方案

1、一、 WB和RT-PCR實驗流程、意義目的l WB實驗流程：1蛋白質(zhì)的樣品制備：取心肌組織50mg，待組織塊自行溶解，用濾紙吸去其表面水分，將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位，用組織剪盡量將其剪碎，將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），將玻璃勻漿器插入冰中，勻漿約30分鐘。將心肌組織勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，412000g離心5分鐘，收集上清（如有粘稠物進一步用超聲處理），樣品分裝凍存于-20備用。2 .測定蛋白濃度：2.1 按50：1配置BCA工作液。2.2 10ulC液（蛋白標準）+90

2、ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標準液。2.3 分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標準液加入96孔板的第18標準孔中，在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。2.4 分別加PBS定容至20ul。2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時。2.6 用酶標儀測定蛋白濃度：測定A562，依標準曲線算出蛋白濃度。3 SDS-PAGE電泳：3.1 制 膠: 按比例配制分離膠，緩緩地搖動溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水，以阻止氧氣進入凝膠溶液中，靜置40min。同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地

3、氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制60min以上以保證完全聚合。3.2 預電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。（目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通）。3.3 樣品準備：首先計算上樣體積，然后按樣品：上樣buffer=4：1的比例加入上樣bufer混勻，沸水煮10分鐘，冰上5分鐘。3.4 加 樣： 預電泳后依次加入標準品（Marker）和待分析樣品。（加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩

4、沖液避免邊緣效應。每個泳道加5ul。3.5 電 泳： 加樣完畢，選擇80V恒壓進行電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處（一般約20分鐘），更換至100V恒壓電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳（一般約為1小時20分鐘）。4轉(zhuǎn) 膜：4.1 切膠：將電泳完畢的膠完整的放在盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中，將目的蛋白所在區(qū)域切下來，測量其長寬，并記錄。4.2 剪膜和濾紙：按膠的尺寸剪膜和濾紙（濾紙長寬較凝膠小0.51mm，PVDF膜長寬較凝膠大0.51mm），濾紙浸入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中10秒鐘，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒鐘，然后將兩者都放入盛有去離子水的玻璃皿中3分鐘，進一步

5、放入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中3分鐘。4.3 向電轉(zhuǎn)槽中倒入部分電轉(zhuǎn)液，將海綿浸入。按如下順序制作“三明治”（注意避免兩邊濾紙相互接觸，以免發(fā)生短路）。從正極到負極按如下順序排列：正極-海綿-雙層濾紙-PVDF膜-凝膠-雙層濾紙-海綿-負極。（其中不能留有氣泡）卡緊轉(zhuǎn)膜板，電轉(zhuǎn)槽中倒?jié)M電轉(zhuǎn)液，將轉(zhuǎn)膜板浸入電轉(zhuǎn)槽中，注意正負極要正確。插上電源，設定恒流20mA轉(zhuǎn)膜，4冰箱中過夜。5、膜的封閉: 用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)，搖床震動，70轉(zhuǎn)/分鐘，室溫封閉1小時30分鐘。6、一抗孵育：6.1 配制一抗：按相應抗體的效價加入一抗稀釋液，一抗稀釋液按0.05% TBST（

6、ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制。6.2一抗孵育：將封閉后的膜放入雜交袋中，加入一抗約1ml，室溫搖床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時30分鐘。6.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。7、二抗孵育：7.1 配制二抗：按相應抗體的效價加入二抗稀釋液，二抗稀釋液按0.05%TBST（ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制。7.2 二抗孵育：將一抗孵育后的膜放入二抗中，室溫搖床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時30分鐘。7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。8、ECL顯色8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例將ECL工作液覆蓋到膜

7、表面，放置12分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。目的意義：l RT-PCR實驗流程：RealTime RT-PCR實驗流程1樣本Total RNA提取 - Trizol法提取組織、細胞Total RNA（1）樣本處理（細菌、細胞不用研磨）；在鋁箔中將1cm2大小左右的組織樣本敲碎，移至已加入鋼珠的Eppendorf管中，使用研磨儀（30 1/s，8min）進行研磨；注：此步操作應盡可能在低溫液氮環(huán)境下操作，細菌、細胞樣本不用研磨。（2）在研磨后的Eppendorf管中加入1ml Trizol，振蕩混勻；（3）將混勻后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200l氯仿，振蕩混勻；（4）離心：4

8、，12000rpm，15min；（5）將離心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500l異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置15min；（6）離心：4，12000rpm，15min；（7）倒掉上清液，加入1ml 75%乙醇，振蕩混勻；（8）離心：4，7500rpm，5min；（9）倒掉上清液，并在超凈臺中將乙醇揮發(fā)干凈；（10）加入4060l DEPC H2O，65 5min助溶；（11）-20冷凍保存。2Total RNA質(zhì)量檢測（1）NanoDrop測定Total RNA濃度（2l Total RNA上樣）（2）1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量Total RNA500ng5

9、15; Loading Buffer2lDEPC H2O to 78l65變性5min，冰浴5minEB（500倍稀釋）1l總體積約為89l甲醛變性瓊脂糖凝膠：30ml 1×TBE Buffer中加入0.45g瓊脂糖，微波爐中加熱溶化，輕輕搖動使瓊脂糖充分混勻（肉眼觀察無顆粒狀懸浮物），冷卻至60左右時加入600l甲醛，混勻，倒入RNA專用的制膠器中（7.5×5.5cm），室溫靜置30min左右即可使用。電泳條件：120130V，1520min。3DNase消化基因組DNATotal RNA1025gRQ1 RNase-Free DNase 10× Reactio

10、n Buffer5lRQ1 RNase-Free DNase2l（5U/l）RNase Inhibitor1l（40U/l）DEPC H2O to 50l37消化30min。4Total RNA純化（1）補RNase-Free H2O使消化純化后Total RNA溶液總體積為100l；（2）在RNA結合柱收集管中加入300l RA1；（3）將100lTotal RNA溶液移至RNA結合柱收集管中，和300l RA1充分混勻；（4）加入300l無水乙醇，充分混勻，并將上述混合液移至RNA結合柱中；（5）離心：室溫，10000rpm，30s；（6）倒掉收集管中的廢棄液，將RNA結合柱移至新的收集管

11、上，加入700l RA3；（7）離心：室溫，10000rpm，30s；（8）倒掉收集管中的廢棄液，加入350l RA3；（9）離心：室溫，10000rpm，2min；（10）將RNA結合柱移至新Eppendorf管中，加入40-60l RNase-Free H2O至結合柱硅膠膜上；（11）離心：室溫，10000rpm，1min；（12）-20冷凍保存。5Total RNA純化效果驗證（1）NanoDrop測定純化后Total RNA濃度（2l純化后Total RNA上樣）（2）1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測Total RNA純化效果純化后Total RNA500ng5× Load

12、ing Buffer2lDEPC H2O to 78l65變性5min，冰浴5minEB（500倍稀釋）1l總體積約為89l甲醛變性瓊脂糖凝膠配置方法及電泳條件均同上述Total RNA質(zhì)量檢測時。6Total RNA消化效果驗證用純化后的Total RNA作為模板對看家基因進行PCR反應，需做陰性對照（不加模板）和陽性對照（已知的cDNA）。（1）PCR反應體系Template（純化后Total RNA）1l（0.3-0.5mg）10×Buffer2.5mldNTPs0.5l（10mM/ml）PrimerForward0.5l（10mM/ml）Reverse0.5l（10mM/ml

13、）r-taq0.5l（10U/ml）Nuclease-Free H2O to 25l（2）PCR程序95 3min，95 30s，58 30s（退火溫度視引物情況來確定），72 30s，72 10min，4 for ever，共進行35個循環(huán)。（3）1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳驗證消化效果PCR產(chǎn)物24l2× Loading Buffer4l總體積約為68l非變性瓊脂糖凝膠：80ml 1×TBE Buffer中加入1.2g瓊脂糖，微波爐中加熱溶化，輕輕搖動使瓊脂糖充分混勻（肉眼觀察無顆粒狀懸浮物），冷卻至60左右時加入2l EB（原液）混勻，倒入制膠器中（15×1

14、5cm），室溫靜置30min左右即可使用。電泳條件：100V，2530min。7RNA逆轉(zhuǎn)錄 - Oligo dT 15法RNA逆轉(zhuǎn)錄（1）逆轉(zhuǎn)錄反應體系Total RNA22.5gOligo（dT）152l（500g/l）DEPC H2O to 11.5l65變性5min，冰浴5min5× 1st Buffer4ml0.1M DTT2mldNTPs1ml（10mM/ml）RNase Inhibitor0.5l（40U/l）M-MLV1l共20l體系（2）逆轉(zhuǎn)錄程序溫?。?5 10min，37 1h，4 for ever。加入5l 1.5M NaOH終止逆轉(zhuǎn)錄反應，70 10min；

15、加入1l 10N乙酸中和；加滅菌水至50l；4低溫保存。8RealTime RT-PCR反應（1）RealTime RT-PCR反應體系Template（cDNA）小于500ng（一般是逆轉(zhuǎn)錄反應體系50ml中的1ml）MgCl21.6mlPrimerForward0.8l（10mM/ml）Reverse0.8l（10mM/ml）DNA Master SYBR Green I MIX2lNuclease-Free H2O to 20ml（2）RealTime RT-PCR程序酶激活95，10min擴增反應95，15s變性5060，5s退火72，15s延伸76，3s熒光檢測共40個循環(huán)溶解曲線7

16、595（3）RealTime RT-PCR產(chǎn)物1.5%非變性（不加甲醛）瓊脂糖凝膠電泳檢測RealTime RT-PCR產(chǎn)物24l2× Loading Buffer4l總體積約為68l非變性（不加甲醛）瓊脂糖凝膠配置方法及電泳條件均同上述Total RNA消化效果驗證時。 儀器、試劑（1）所用試劑名稱公司目錄號備注TrizolInvitrogen15596-0265× Loading BufferTakaraRQ1 RNase-Free DNaseRQ1 RNase-Free DNase 10× Reaction BufferPromegaM6101Recombinant RNasin Ribonuclease InhibitorPromegaN251510× PCR BufferTakaradNTPsPromegar-taqTakaraR10T1Oligo（dT）15Promega5× 1st BufferInvitrogen0.1M DTTInvitrogenM-MLVInvitrogen10777-019LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche12239264001LightCycler Centrifuge AdaptersRoche11909312001Li