人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在重組痘苗病毒中的表達及對重組病毒免疫效果的影響

1、    人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子在重組痘苗病毒中的表達及對重組病毒免疫效果的影響        【摘要】目的觀察人GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)對重組痘苗病毒免疫效果的影響。方法大鼠體內(nèi)觀察。結(jié)果從核酸和蛋白水平均證實重組痘苗病毒RVJSB1175D/GM-CSF可同時表達GM-CSF及HSV- 1gD(單純皰疹病毒gD糖蛋白)，但RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠產(chǎn)生的抗-HSV1gD特異性抗體水平與RVJSB1175D組相比無顯著性差異。結(jié)論人G

2、M-CSF在大鼠體內(nèi)對特異免疫調(diào)節(jié)作用不明顯，可能與GM-CSF主要促使非特異性細胞免疫增強所致有關(guān)?！局黝}詞】痘苗病毒人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子單純皰疹病毒酶聯(lián)免疫吸附測定 Expression of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF)by recombinant vaccinia virus and its effect on immunogenicityLiu Hongbing,Zhang Zhiqing, Yao Lihong, et al. Institute of Virology,Ch

3、inese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052AbstractKey words:Vaccinia virusHuman granulocyte-macrophagecolony stimulating factorHerpes simplex vrusEnzyme-linked immunosorbent assay將細胞因子導(dǎo)入痘苗病毒已成為研制高效、安全的基因工程多價疫苗有效途徑。國內(nèi)外均有利用痘苗病毒載體成功表達IL-2等多種細胞因子的報道，動物實驗表明，細胞因子基因插入痘苗病毒后，對病毒本身的毒力，或?qū)Σ《舅磉_的外源蛋白的免

4、疫效果有明顯影響1，2。GM-CSF是一種造血生長的因子，它除促使骨髓前體細胞的增殖、分化、成熟外，還可促使粒細胞、巨噬細胞增殖及其功能增強，從而從不同環(huán)節(jié)對機體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子3。迄今國內(nèi)外有關(guān)人GM-CSF在重組痘苗病毒中的表達及對免疫效果的影響尚未見報道。我們構(gòu)建了可同時表達GM-CSF與型單純皰疹病毒gD糖蛋白(HSV-1gD)的重組痘苗病毒，并在動物體內(nèi)進行了免疫效果觀察。1材料和方法1.1載體pCD/GM-CSF由北京醫(yī)科大學(xué)陳慰峰教授提供，是將GM-CSF基因克隆于PCD質(zhì)粒的 BamH I位點。pJSB1175D，7.5K啟動子下游為HSV-1 16

5、8株gD糖蛋白基因，由病毒基因工程國家重點實驗室崔虹博士提供。1.2病毒與細胞痘苗病毒天壇株VV和HSV-1 168株由病毒基因工程國家重點實驗室保存。RVJ120/GM-CSF、RVJSB1175D分別為pJ120/GM-CSF、pJSB1175D質(zhì)粒與VV共轉(zhuǎn)染后獲得的重組病毒，RVJSB1175D由病毒基因工程國家重點實驗室崔虹博士提供，RVJ120/GM-CSF自備。TK-143、Vero-E6及TF-1細胞均為病毒基因工程國家重點實驗室保存。原代雞胚細胞自備。1.3動物與試劑WISTAR大鼠購于醫(yī)科院動物養(yǎng)殖場。HSV-1gD單克隆抗體由崔虹博士提供。IgG-FITC和HRP-IgG

6、購于華美公司。1.4重組病毒的篩選與純化按文獻4。1.5聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及Southern blot分析病毒DNA的提取參閱文獻5。PCR反應(yīng)體系為：10×Taq 緩沖液(Mg?free)5l，25mmol/LmgCl2 3l，2.5 mmocl/L mgcl2 3ul， 2-5mmol/L dNTP 3l,5，3引物各1l，模板為病毒DNA經(jīng)Hind酶切后的酶解物3l，加水補到49l，煮3分鐘冷卻后加Taq酶1l(3U)，PCR循環(huán)參數(shù)：9445s，5545s，7245s，共循環(huán)30次，最后72延伸10分鐘。核酸電泳及轉(zhuǎn)膜雜交見文獻6，地高辛探針標(biāo)記參照Boehringer

7、Mamnhein公司使用說明書。1.6HSV-1gD表達產(chǎn)物的免疫熒光檢測見文獻7。1.7GM-CSF生物學(xué)活性的檢測見文獻8。1.8重組病毒表達的GM-CSF對免疫原性的影響同性別體重80g左右WISTAR大鼠隨機分成3組，每組4只，分別接種VV、RVJSB1175D、RVJSB1175D/GM-CSF，每只接種3×107PFU，以腹腔、皮下、靜脈(4：2：1)聯(lián)合接種，初種后2周加強免疫1次，免疫途徑及免疫劑量與初免相同，免疫前及免疫后每周尾靜脈采血1次，按常規(guī)方法分離血清，-20保存，最后同時檢測。1.9抗-HSV-1gD抗體的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和中和試驗，

8、文法參考文獻9。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamH I將人GM-CSF從PCD/GM-CSF切下，插入pJSB1175DRP11K啟動子下游Bgl 位點，得到重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF，酶切譜分析證實GM-CSF正向正確插入。2.2重組病毒的Southern blot及PCR-Southern blot分析利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF與痘苗病毒天壇株共轉(zhuǎn)染TK 143，經(jīng)BudR加壓選擇，通過免疫熒光篩選，獲得表達GM-CSF和HSV-1gD的重組病毒RVJSB1175D/GM-CSF。以該病毒DNA的Hind酶解物為模板，采用上游引物5-TA

9、GAATTCGATCCAGCCCGTCGTTCACCCAGCCC-3，下游引物5-CTGGATCCTTAATTCCTGGACTGGCTC-3擴增出一段大小約0.4kb片段，與預(yù)期相符，且轉(zhuǎn)膜后進行的Southern blot分析亦證實該片段為特異性擴增產(chǎn)物(2)。2.3RVJSB1175D/GM-CSF重組病毒感染細胞上清中GM-CSF的活性檢測RVJSB1175D/GM-CSF與RVJ120D/GM-CSF均按PFU細胞感染TK-143，收集48小時的上清，10 000r/min離心5分鐘，上清經(jīng)TF-1檢測，表明兩者均有良好維持TF-1細胞生長的能力，且兩重組病毒表達的GM-CSF活性沒有

10、顯著性差別(表1)。表明重組病毒表達GM-CSF不受同時表達的HSV-1gD的影響，即兩者可在同一病毒中共表達。表1重組病毒在TK-143細胞表達GM-CSF活性的比較Tab.1Comparison of the activity of GM-CSF expressed by recombinant vaccinia virus病毒VirusGM-CSF活性(ng/ml)GM-CSF activityRVJ120/GM-CSF101.3+/-5.1RVJSB1175D/GM-CSF97.3+/-4.5RVJ1200     表2重組病毒免疫血清抗-HSV

11、-1活性的檢測(噬斑數(shù))Tab.2Neutralization activity of sera from immunized rats against HSV-1 (No. Plague)免疫用病毒Virus for immunization抗血清稀釋倍數(shù)Anti- serum dilution18132164RVJSB1175D/GM-CSF025RVJSB1175D001VV408050正常血清對照Normal serum435658    1重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF的結(jié)構(gòu)Fig. 1Structure map of pJSB117

12、5D/GM-CSF    2重組病毒DNA的PCR-Southern blot分析A：電泳；B：雜交Fig. 2PCR-Southern blot of DNA of recombinant virusA: Electrophoresis; B:Southern blot1:PCD/GM-CSF. 2:RVJSB1175D/GM-CSF; 3: DNA /Hind 3免疫大鼠血清特異性抗體的ELISA檢測結(jié)果Fig. 3ELISA test of antibodies in sera of immunized rats against VV and HS

13、V-1gD Serum dilution 140     2.4RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠后血清抗體水平的檢測RVJSB1175D/GM-CSF，RVJSB1175D及VV分別免疫大鼠，于初免后5周即加強免疫后3周，采血檢測血清特異性抗體水平，經(jīng)中和試驗及ELISA檢測，結(jié)果見表2，3。由此可見，RVJSB 1175D/GM-CSF免疫大鼠，可產(chǎn)生較好特異性免疫，血清1：64稀釋仍有較好中和活性，與不含GM-CSF的RVJSB1175D組相比，無論ELISA滴度，還是中和活性均無顯著性差別。表明無論RVJSB1175D，還是RVJSB11

14、75D/GM-CSF，在大鼠體內(nèi)繁殖的同時均能表達HSV-1gD，且表達產(chǎn)物可刺激動物產(chǎn)生具有中和HSV-1能力的特異性抗體。3討論隨著細胞因子免疫調(diào)節(jié)作用的深入研究，細胞因子在免疫反應(yīng)中的作用逐步得到重視，并開始利用這些細胞因子來調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)，其中研究得較多的是：制備轉(zhuǎn)細胞因子疫苗，以期獲得高效安全的基因工程疫苗；制備轉(zhuǎn)細胞因子瘤苗，用于抑制腫瘤生長、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移9；基因工程法生產(chǎn)的細胞因子直接用于病毒病和腫瘤的治療。本研究中，將hGM-CSF基因及HSV-1gD分別克隆于痘苗病毒載體pJSB1175的P11K及P7.5K啟動子下游，構(gòu)建的表達質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF與痘苗

15、病毒天壇株共轉(zhuǎn)染TK 143，經(jīng)篩選獲得可同時表達GM-CSF及HSV-1gD的重組病毒，且兩者無干擾作用，從而為研究GM-CSF的佐劑作用提供可能。我們比較了RVJSB1175D/GM-CSF與RVJSB1175D免疫WISTAR大鼠，痘苗病毒抗體和HSV-1gD抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果表明兩者在上述兩組沒有明顯差別，這可能與GM-CSF主要促使非特異細胞免疫增強，而對特異性免疫調(diào)節(jié)作用不明顯所致。而痘苗病毒免疫大鼠后痘苗病毒抗體水平明顯高于RVJSB 1175D/GM-CSF組和RVJSB1175D組，可能是由于兩重組病毒的TK區(qū)有外源基因插入，使病毒本身的毒力有所降低所致。本文受國家863高

16、科技生物技術(shù)領(lǐng)域基金資助作者單位：100052北京中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室1997年6月25日收稿11月20日修回參考文獻1Flexner C,Moss B,William T,et al.Attenuation and immunogenicity in primates of vaccinia virus recombinants expressing hIL-2.Vaccine,1990,8:17-21.2王琴.碩士論文.北京：中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，1995.3Gasson J C.Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulatihg factor.Blood,1991,77(6):1131-1145.4高峰，劉崇柏，伊瑤，等.用重組病毒載體表達甲型肝炎病毒抗原.病毒學(xué)報，1989,5:303-311.5Golini F,Kates J.Transcriptional and translational ana