人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子在重組痘苗病毒中的表達(dá)及對(duì)重組病毒免疫效果的影響

1、    人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子在重組痘苗病毒中的表達(dá)及對(duì)重組病毒免疫效果的影響        【摘要】目的觀察人GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)對(duì)重組痘苗病毒免疫效果的影響。方法大鼠體內(nèi)觀察。結(jié)果從核酸和蛋白水平均證實(shí)重組痘苗病毒RVJSB1175D/GM-CSF可同時(shí)表達(dá)GM-CSF及HSV- 1gD(單純皰疹病毒gD糖蛋白)，但RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠產(chǎn)生的抗-HSV1gD特異性抗體水平與RVJSB1175D組相比無(wú)顯著性差異。結(jié)論人G

2、M-CSF在大鼠體內(nèi)對(duì)特異免疫調(diào)節(jié)作用不明顯，可能與GM-CSF主要促使非特異性細(xì)胞免疫增強(qiáng)所致有關(guān)。【主題詞】痘苗病毒人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子單純皰疹病毒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 Expression of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF)by recombinant vaccinia virus and its effect on immunogenicityLiu Hongbing,Zhang Zhiqing, Yao Lihong, et al. Institute of Virology,Ch

3、inese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052AbstractKey words:Vaccinia virusHuman granulocyte-macrophagecolony stimulating factorHerpes simplex vrusEnzyme-linked immunosorbent assay將細(xì)胞因子導(dǎo)入痘苗病毒已成為研制高效、安全的基因工程多價(jià)疫苗有效途徑。國(guó)內(nèi)外均有利用痘苗病毒載體成功表達(dá)IL-2等多種細(xì)胞因子的報(bào)道，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞因子基因插入痘苗病毒后，對(duì)病毒本身的毒力，或?qū)Σ《舅磉_(dá)的外源蛋白的免

4、疫效果有明顯影響1，2。GM-CSF是一種造血生長(zhǎng)的因子，它除促使骨髓前體細(xì)胞的增殖、分化、成熟外，還可促使粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖及其功能增強(qiáng)，從而從不同環(huán)節(jié)對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子3。迄今國(guó)內(nèi)外有關(guān)人GM-CSF在重組痘苗病毒中的表達(dá)及對(duì)免疫效果的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。我們構(gòu)建了可同時(shí)表達(dá)GM-CSF與型單純皰疹病毒gD糖蛋白(HSV-1gD)的重組痘苗病毒，并在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了免疫效果觀察。1材料和方法1.1載體pCD/GM-CSF由北京醫(yī)科大學(xué)陳慰峰教授提供，是將GM-CSF基因克隆于PCD質(zhì)粒的 BamH I位點(diǎn)。pJSB1175D，7.5K啟動(dòng)子下游為HSV-1 16

5、8株gD糖蛋白基因，由病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室崔虹博士提供。1.2病毒與細(xì)胞痘苗病毒天壇株VV和HSV-1 168株由病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RVJ120/GM-CSF、RVJSB1175D分別為pJ120/GM-CSF、pJSB1175D質(zhì)粒與VV共轉(zhuǎn)染后獲得的重組病毒，RVJSB1175D由病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室崔虹博士提供，RVJ120/GM-CSF自備。TK-143、Vero-E6及TF-1細(xì)胞均為病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。原代雞胚細(xì)胞自備。1.3動(dòng)物與試劑WISTAR大鼠購(gòu)于醫(yī)科院動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。HSV-1gD單克隆抗體由崔虹博士提供。IgG-FITC和HRP-IgG

6、購(gòu)于華美公司。1.4重組病毒的篩選與純化按文獻(xiàn)4。1.5聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及Southern blot分析病毒DNA的提取參閱文獻(xiàn)5。PCR反應(yīng)體系為：10×Taq 緩沖液(Mg?free)5l，25mmol/LmgCl2 3l，2.5 mmocl/L mgcl2 3ul， 2-5mmol/L dNTP 3l,5，3引物各1l，模板為病毒DNA經(jīng)Hind酶切后的酶解物3l，加水補(bǔ)到49l，煮3分鐘冷卻后加Taq酶1l(3U)，PCR循環(huán)參數(shù)：9445s，5545s，7245s，共循環(huán)30次，最后72延伸10分鐘。核酸電泳及轉(zhuǎn)膜雜交見(jiàn)文獻(xiàn)6，地高辛探針標(biāo)記參照Boehringer

7、Mamnhein公司使用說(shuō)明書(shū)。1.6HSV-1gD表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光檢測(cè)見(jiàn)文獻(xiàn)7。1.7GM-CSF生物學(xué)活性的檢測(cè)見(jiàn)文獻(xiàn)8。1.8重組病毒表達(dá)的GM-CSF對(duì)免疫原性的影響同性別體重80g左右WISTAR大鼠隨機(jī)分成3組，每組4只，分別接種VV、RVJSB1175D、RVJSB1175D/GM-CSF，每只接種3×107PFU，以腹腔、皮下、靜脈(4：2：1)聯(lián)合接種，初種后2周加強(qiáng)免疫1次，免疫途徑及免疫劑量與初免相同，免疫前及免疫后每周尾靜脈采血1次，按常規(guī)方法分離血清，-20保存，最后同時(shí)檢測(cè)。1.9抗-HSV-1gD抗體的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和中和試驗(yàn)，

8、文法參考文獻(xiàn)9。2結(jié)果2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建用BamH I將人GM-CSF從PCD/GM-CSF切下，插入pJSB1175DRP11K啟動(dòng)子下游Bgl 位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF，酶切譜分析證實(shí)GM-CSF正向正確插入。2.2重組病毒的Southern blot及PCR-Southern blot分析利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF與痘苗病毒天壇株共轉(zhuǎn)染TK 143，經(jīng)BudR加壓選擇，通過(guò)免疫熒光篩選，獲得表達(dá)GM-CSF和HSV-1gD的重組病毒RVJSB1175D/GM-CSF。以該病毒DNA的Hind酶解物為模板，采用上游引物5-TA

9、GAATTCGATCCAGCCCGTCGTTCACCCAGCCC-3，下游引物5-CTGGATCCTTAATTCCTGGACTGGCTC-3擴(kuò)增出一段大小約0.4kb片段，與預(yù)期相符，且轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行的Southern blot分析亦證實(shí)該片段為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(2)。2.3RVJSB1175D/GM-CSF重組病毒感染細(xì)胞上清中GM-CSF的活性檢測(cè)RVJSB1175D/GM-CSF與RVJ120D/GM-CSF均按PFU細(xì)胞感染TK-143，收集48小時(shí)的上清，10 000r/min離心5分鐘，上清經(jīng)TF-1檢測(cè)，表明兩者均有良好維持TF-1細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，且兩重組病毒表達(dá)的GM-CSF活性沒(méi)有

10、顯著性差別(表1)。表明重組病毒表達(dá)GM-CSF不受同時(shí)表達(dá)的HSV-1gD的影響，即兩者可在同一病毒中共表達(dá)。表1重組病毒在TK-143細(xì)胞表達(dá)GM-CSF活性的比較Tab.1Comparison of the activity of GM-CSF expressed by recombinant vaccinia virus病毒VirusGM-CSF活性(ng/ml)GM-CSF activityRVJ120/GM-CSF101.3+/-5.1RVJSB1175D/GM-CSF97.3+/-4.5RVJ1200     表2重組病毒免疫血清抗-HSV

11、-1活性的檢測(cè)(噬斑數(shù))Tab.2Neutralization activity of sera from immunized rats against HSV-1 (No. Plague)免疫用病毒Virus for immunization抗血清稀釋倍數(shù)Anti- serum dilution18132164RVJSB1175D/GM-CSF025RVJSB1175D001VV408050正常血清對(duì)照Normal serum435658    1重組質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF的結(jié)構(gòu)Fig. 1Structure map of pJSB117

12、5D/GM-CSF    2重組病毒DNA的PCR-Southern blot分析A：電泳；B：雜交Fig. 2PCR-Southern blot of DNA of recombinant virusA: Electrophoresis; B:Southern blot1:PCD/GM-CSF. 2:RVJSB1175D/GM-CSF; 3: DNA /Hind 3免疫大鼠血清特異性抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig. 3ELISA test of antibodies in sera of immunized rats against VV and HS

13、V-1gD Serum dilution 140     2.4RVJSB1175D/GM-CSF免疫大鼠后血清抗體水平的檢測(cè)RVJSB1175D/GM-CSF，RVJSB1175D及VV分別免疫大鼠，于初免后5周即加強(qiáng)免疫后3周，采血檢測(cè)血清特異性抗體水平，經(jīng)中和試驗(yàn)及ELISA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2，3。由此可見(jiàn)，RVJSB 1175D/GM-CSF免疫大鼠，可產(chǎn)生較好特異性免疫，血清1：64稀釋仍有較好中和活性，與不含GM-CSF的RVJSB1175D組相比，無(wú)論ELISA滴度，還是中和活性均無(wú)顯著性差別。表明無(wú)論RVJSB1175D，還是RVJSB11

14、75D/GM-CSF，在大鼠體內(nèi)繁殖的同時(shí)均能表達(dá)HSV-1gD，且表達(dá)產(chǎn)物可刺激動(dòng)物產(chǎn)生具有中和HSV-1能力的特異性抗體。3討論隨著細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)作用的深入研究，細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中的作用逐步得到重視，并開(kāi)始利用這些細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，其中研究得較多的是：制備轉(zhuǎn)細(xì)胞因子疫苗，以期獲得高效安全的基因工程疫苗；制備轉(zhuǎn)細(xì)胞因子瘤苗，用于抑制腫瘤生長(zhǎng)、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移9；基因工程法生產(chǎn)的細(xì)胞因子直接用于病毒病和腫瘤的治療。本研究中，將hGM-CSF基因及HSV-1gD分別克隆于痘苗病毒載體pJSB1175的P11K及P7.5K啟動(dòng)子下游，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pJSB1175D/GM-CSF與痘苗

15、病毒天壇株共轉(zhuǎn)染TK 143，經(jīng)篩選獲得可同時(shí)表達(dá)GM-CSF及HSV-1gD的重組病毒，且兩者無(wú)干擾作用，從而為研究GM-CSF的佐劑作用提供可能。我們比較了RVJSB1175D/GM-CSF與RVJSB1175D免疫WISTAR大鼠，痘苗病毒抗體和HSV-1gD抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果表明兩者在上述兩組沒(méi)有明顯差別，這可能與GM-CSF主要促使非特異細(xì)胞免疫增強(qiáng)，而對(duì)特異性免疫調(diào)節(jié)作用不明顯所致。而痘苗病毒免疫大鼠后痘苗病毒抗體水平明顯高于RVJSB 1175D/GM-CSF組和RVJSB1175D組，可能是由于兩重組病毒的TK區(qū)有外源基因插入，使病毒本身的毒力有所降低所致。本文受?chē)?guó)家863高

16、科技生物技術(shù)領(lǐng)域基金資助作者單位：100052北京中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1997年6月25日收稿11月20日修回參考文獻(xiàn)1Flexner C,Moss B,William T,et al.Attenuation and immunogenicity in primates of vaccinia virus recombinants expressing hIL-2.Vaccine,1990,8:17-21.2王琴.碩士論文.北京：中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，1995.3Gasson J C.Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulatihg factor.Blood,1991,77(6):1131-1145.4高峰，劉崇柏，伊瑤，等.用重組病毒載體表達(dá)甲型肝炎病毒抗原.病毒學(xué)報(bào)，1989,5:303-311.5Golini F,Kates J.Transcriptional and translational ana