成骨、成脂誘導

1、間充質干細胞成骨及成脂誘導培養(yǎng)基標準 制作方法瀏覽：185更新：2013-07-01 11:12間充質干細胞培養(yǎng)細胞誘導分化時必然用到的就是培養(yǎng)液，配置出合適的培養(yǎng)液 能夠促進細胞的分化，因此這一步操作時相當?shù)年P鍵。如何才能配置適合的誘導 培養(yǎng)液呢？濟南中賽生物來介紹成骨與成脂誘導培養(yǎng)液的配備方法。成骨誘導培養(yǎng)液配備與誘導操作：1準備含10%FBS的a-MEM培養(yǎng)液；2在備好的沁IEM培養(yǎng)液中添加50uM抗壞血酸,lOmmp-磷酸甘油和l()()nm地塞 米松；3準備6孔培養(yǎng)板，將P4細胞按照5X103個/平方厘米的規(guī)格接種于原始培養(yǎng)液中；4待細胞長至基本融合后，更換上述制備完成的成骨誘導培養(yǎng)

2、液；5每三天換液一次，細胞長至7天時進行堿性磷酸酶染色；6二十八天后再進行礦化結節(jié)的茜素紅染色。茜素紅染色方法介紹:1去除細胞當前使用培養(yǎng)液，使用PES清洗兩次；2使用10%甲醛室溫固定15分鐘，完成后使用重蒸館水沖洗兩次；3按照1 ml/孔加入40mM的茜素紅染色液，室溫孵育20min并輕微振蕩；4清除掉沒有完全結合的染料，用重蒸憾水漂洗并振蕩5min重復4次；5傾斜放置2min,吸取多余的重蒸館水；倒置顯微鏡觀察抬照記錄。成脂誘導培養(yǎng)液配備與誘導操作：1配置FBS10%含量的HG-DMEM培養(yǎng)液；2在配制完成的HG-DMEM培養(yǎng)液中加入1卩1地塞米松,10Mg/ml胰島素，2()(加M耐喙

3、美辛和0.5mM IBMX;3準備6孔培養(yǎng)板，將P4細胞按照2X104個/平方厘米的規(guī)格接種于原始HG-PMEI培養(yǎng)液中4待細胞長至基本融合后，更換上述制備完成的成脂誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，在用 只含有l(wèi)(Wml胰島素的成脂維持培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，如此交替循環(huán)培養(yǎng)至14天, 使用紅油O染色。紅油()染色方法介紹：1 去除細胞使用的當前培養(yǎng)液，使用PES清洗兩次;2.27.5%甲醛室溫固定20分鐘；3. 重蒸惚水清洗3此，空氣中干燥；4. 加入().5%的紅油室溫孵育一小時;5配制70%乙醇溶液清洗3次；6 倒置顯微鏡觀察拍照記錄。丁香園二、誘導成骨體系1.試劑溶劑終濃度儲存濃度1ml體系加長Dex 去

4、商于水 0-W ImM 0.1 pLVc PBS50mM lpLA誘酸甘油 PBS 10mM IM 10pL2. DMEM (HG)和 10%FBSo3. 3代以上細胞，24孔板每孔105個細胞，六孔板每孔6000個細胞，每三天半星換液， 共誘導2周。成骨誘導劑：地塞米松(lX10-8moi/L), p-甘袖誘酸鈉10mmol/L.維生素C 50ng/ml,高 糖PMEM,青錐霉素各100u/ml,體積分教10%的胎牛血清。成骨誘導培養(yǎng)墓成分:兔骨髓間質干細胞成骨誘導分化墓礎培養(yǎng)墓175 mL兔骨髓間質干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 mL谷氨磁2 mL雙抗2 mL抗壞血酸400 pLP甘油誡酸鈉2

5、 mL地塞米松20 pL成脂誘導培養(yǎng)基成分:兔骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基A液兔骨髓間質干細胞成脂誘導分化基礎培養(yǎng)墓A175 mL兔骨髓間質干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2mL雙抗2 mL胰島素40() pLIBMN （1BMN, 3-異丁基亠甲基黃瞟吟）200 piL羅格列酮（呵嗥美辛）200 jiL地塞米松200 jiL兔骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基B液兔骨髄間質干細胞成脂誘導分化墓礎培養(yǎng)墓B175 mL兔骨髄間質干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 mL雙抗2 mL谷氨酰胺2 mL胰島素400 jiL對成脂肪誘導要特別提醪你，用國產血清比進口的效果更好（仍為10%濃度）。我用的是

6、S1GMA的地塞米松（D1756）, 25mg包裝的，248元貴的驚人！須用無水乙醇溶 解。我也用過病房常用的5tng的地塞米松磷酸鈉，效果也挺好的。首選的是dcxamcthasonc-watcr soluble, cell culture tested0至少可以配成1:100（）的母液，使用起來很方便。 使用丟用制劑尤其要小心溶劑的問題，奸些制劑不是和解在水里的，如果你沒有設置臺適的陰性對照，會 給你的實驗帯來Bugo脂肪誘導培養(yǎng)液：PMEMJ0%FCS, 10-6M地塞米松,100微克/ml 1一甲墓一 3 異丁墓一黃嚓吟，50微克/ml抗壞血酸。很難找到一套抗兔的抗體。油紅染色的方法如下

7、：脂肪油紅染色（原位）：1稱取0.5g油紅干粉，溶于100mL異丙醇中，配成0.5%油紅儲存液，棕色瓶保存。2除去培養(yǎng)基用PBS洗滌1遍3.加10%中性甲整固定5min4稀釋油紅儲存液，油紅法離于水= 3:2,濾紙過濾，室溫放直10min （除去一些雜質，染色 結果更清晰）5.染色30min,如果是培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，加的體積覆蓋住板底即可。如6孔加1.5ml, 24孔加0.5-lmlo6.顯微鏡觀察，及時照相，時間過長，脂肪滴會自發(fā)確裂，到時就前功盡棄了，幾個星期 的努力歐！這位大蝦的油紅染色方法基本正確，但有幾個地方修改一下后效果會更好！第一，染色的時間減少到5-10分鐘足夠了，剩下更多一些拍照的時間