基因突變的檢測方法

1、基因突變的檢測方法基因突變的檢測方法 基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一， 檢測方法也隨之迅速發(fā)展。 人類細(xì)胞癌 基因的突變類型已如上所述，對于基因突變的檢測， 1985 以前，利用 Southern 印跡法，可 以篩選出基因的缺失、 插入和移碼重組等突變形式。 對于用該法法不能檢測的突變， 只能應(yīng) 用復(fù)雜費時的 DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction,PCR )技 術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展， 使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展， 目前幾乎所有的基因 突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于 PCR的基礎(chǔ)之上， 并且由 PCR衍生出的新方法不

2、斷出現(xiàn)， 目前已達(dá)二十余種， 自動化程度也愈來愈高， 分析時間大大縮短， 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很 大很提高。 其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性 ( single-strand comformational polymorphism,SSCP ) 和異源雙鏈分析法( heteroduplex analysis,HA )。下面分別介紹幾種 PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典 突變檢測方法，可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考。PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上， 短的單鏈 DNA和 RNA分子依其大街 基序列不同而形成不同構(gòu)象， 一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動速度改 變。其

3、基本原理為單鏈 DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)， 這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成， 即使一個堿基的不同， 也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。 由于該法簡單快速， 因 而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測小于 200bp 的 PCR產(chǎn)物時，突變檢出率可達(dá) 70-95 ，片段大于 400bp 時，檢出率僅為 50左右，該法可能會存在 1的假 陽性率。應(yīng)用 PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影 響，同時該法不能測定突變的準(zhǔn)確位點，還需通過序列分析來確定。 Sarkar 等認(rèn)為對于大 于 200bp 的片段， 用其 RNA分子來做 SSC

4、P會提高其錄敏度。 應(yīng)用 PCR-SSCP檢測點突變已見 報道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。 檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因， 也是檢測抑癌基因 p53 突變最常用的方法， 僅檢測 第 5-8 外顯子即可發(fā)現(xiàn) 85 以上的 p53 基因突變。由于該法簡便快速，特別適合大樣本基 因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法( HA) HA 法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型 DNA形成的異源雜合雙鏈 DNA在其錯配處會形成一突起， 在非變性凝膠中電泳 時，會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙 DNA不同的遷移率。 該法與 SSCP相似

5、， 所不同的是 SSCP分離的 是單鏈 DNA， HA法分離的是雙鏈 DNA，也只適合于小片段的分析。但 HA對一些不能用 SSCP 檢出的突變有互補作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100。突變體富集 PCR法( mutant-enriched PCR )本法的基本原理是利用 ras 基因家族某個密碼 子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點， 如 K-ras 基因第 12 密碼子的 BstNI 位點， 第 13 密古 巴子有 Bg位點。 用鏈續(xù)二次的巢式 PCR來擴(kuò)增包括 K-ras 第 12、13 密碼子的 DNA片段， 在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶

6、切而不能進(jìn)入第二次 PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。變性梯度凝膠電泳法( denaturing gradinent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析 PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá) 100，檢測片段可達(dá) 1kb ，最適 圍為 100bp-500bp ?；驹砘诋?dāng)雙鏈 DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與 DNA變性濕度一致 的凝膠位置時， DNA發(fā)生部分解鏈， 電泳適移率下降， 當(dāng)解鏈的 DNA鏈中有一個堿基改變時， 會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程而被分離。 由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率

7、來檢測， 需要一套專用的電泳裝置， 合成 的 PCR引物最好在 5 末端加一段 40bp-50bp 的 GC夾，以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。 在 DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法(溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE )。 DGGE和 TGGE均有商品化的電泳裝置， 該法一經(jīng)建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選?；瘜W(xué)切割錯配法( chemical cleavage of mismatch,CCM) CCM為在 Maxam-Gilbert 測序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項檢測突變的技術(shù)， 其檢測突

8、變的準(zhǔn)確性可與 DNA測序相仿。 其基本原理 為將待測含 DNA片段與相應(yīng)的野生型 DNA片段或 DNA和 RNA片段混俁變性雜交， 在異源雜合 的雙鏈核酸分子中， 錯配的 C能被羥胺或哌啶切割， 錯配的 T 能被四氧化餓切割， 經(jīng)變性凝 膠電泳即可確定是否存在突變。 該法檢出率很高， 也是檢片段最長的方法， 已有報功檢測了 片段，如果同時對正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度，可檢測到 10 個細(xì)胞中的 1 個突變細(xì)胞。該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢 測法( catodiimide,CDI ) ,CDI 為無毒物質(zhì)，也可檢測大片段 DNA的點突變。等位

9、基因特異性寡核苷酸分析法( allele-specific oligonucleotide,ASO ) ASO 為一種以 雜交為基礎(chǔ)對已知突變的檢測技術(shù)。以PCR和 ASO相結(jié)合，設(shè)計一段 20bp 左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品 DNA雜交?？梢杂酶鞣N突變類型的寡核苷酸探針， 同時以野生型探針為對照， 如出現(xiàn)陽性雜交帶， 則表運河樣品中存在與該 ASO探針相應(yīng)的點突變， ASO需嚴(yán)格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對照 避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。DNA芯片技術(shù)( DNA chip) DNA芯片技術(shù)是

10、90年代后發(fā)展的一項 DNA分析新技術(shù)，它集合 了集成電路計算機(jī)、 激光共聚焦掃描、 熒光標(biāo)記探針和 DNA合成等先進(jìn)技術(shù)。 可用于基因定 位、 DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在 1 塊集成電路板上， 彼此之間重疊1 個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變 DNA發(fā)別與 2 塊 DNA芯片雜交， 由于至少存在 1 個堿基的差異， 正常和突變的 DNA將會得到不同的雜交圖譜， 經(jīng) 過共聚集顯微鏡分別檢測兩種 DNA分子產(chǎn)生的熒光信號， 即可確定是否存在突變， 該方法快 速簡

11、單、 片動化程度高， 具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ?將在基因突變檢測中心發(fā)揮非常重要的作用。連接酶鏈反應(yīng)( ligase chain reaction,LCR ) 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，其最大特點為可 準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個基因突變，由 Landegree 于 1988 年首次應(yīng)用于鐮刀獎細(xì)胞貧血的 分子診斷。 LCR是以 DNA連接酶將某一 DNA鏈的 5- 磷酸與另一相鄰鏈 3- 羥基連接為基礎(chǔ)， 應(yīng)用兩對互補的引物，雙鏈 DNA經(jīng)加熱變性后，兩對引物分別與模板復(fù)性，若完全互補，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的 5- 磷酸與 3- 羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一 次的連接產(chǎn)物又作為下一次循

12、環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。 LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這 32p 標(biāo)記上游引物 3未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加 以鑒定，其檢測敏感性達(dá)到 200個靶分子。也可設(shè)計 1 個橫跨兩引物的檢測探針，用它與 LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt 在 1994 年發(fā)展了一種更為簡的方法， 好微孔板夾心雜交法。由于 LCR的快速、 特蛋和敏感的特性， 以及 能檢測單個堿基突變的能力， 因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷， 并與 PCR結(jié)合用以提 高其敏感性。等位基因特異性擴(kuò)增法 ( Allele-specific amplifica

13、tion,ASA )ASA于 1989 年建立，是 PCR 技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutationsystem,ARMS)、等位基因特性 PCR(allele-specificPCR,ASPC)R 等，用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。該法通過設(shè)計兩個 5 端引物，一個與正常 DNA互補，一個與突變 DNA互補， 對于純合性突變， 分別加入這兩種引物及 3 端引物進(jìn)行兩個平行 PCR，吸有與突變 DNA完互 補的引物才可延伸并得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3 端則導(dǎo)致 PCR不能延伸，則稱為 ARM。S ARMS和 ASPC

14、R借鑒多重 PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位 基因突變位點。 ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸，特別是當(dāng)錯配堿基為 G：T時，這時可通過調(diào)整實驗條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。 在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。 還可 通過在引物 3 端的第二個堿基引入一個錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯 誤延伸。RNA酶 A切割法( RNase A cleavage ) 在一定條件下， 氨基源雙鏈核酸分子 RNA：RNA或 RNA： DNA中的錯配堿基可被 RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變

15、性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時， RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯配堿基為嘧啶 時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈，突變檢出率只有 30，如同時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70。該法需要制備 RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于 1-2kb 的大片段進(jìn)行檢測， 并能確定突變位點。 于這些優(yōu)越性，它仍被作為一 種經(jīng)典方法用于對未知突變進(jìn)行分析。染色體原位雜交( In situ hybridization of chromosome )染色體發(fā)現(xiàn)距今已有 150 多年 的歷史， 染色體檢測被廣泛用于動、 植物及人類的細(xì)胞遺傳學(xué)研究

16、， 隨著染色體分技術(shù)和分 子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。 染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大， 特別是用于腫瘤分子診斷。 腫瘤細(xì)胞的 染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面， 原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)， 腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸 變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細(xì)胞核型 的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、 鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染 色體的檢測方法進(jìn)展很快，檢測的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和 PRINS 法。熒光原位雜交技術(shù)( fluorescent in situ h

17、ybridiaation,FISH )創(chuàng)建于 1986 年。 1969 年 Gall 和 Pardue 首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應(yīng)用核 素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百 堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。 FISH 具有探針穩(wěn)定、操作安 全，可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優(yōu)點。 FISH 的靈敏感與探針標(biāo)記方法和 檢測儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強(qiáng)度。 FISH 探針 一般采用隨機(jī)引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入 FISH 探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到。應(yīng)用慢掃描 CCD配合影

18、像處理理軟件，增強(qiáng)信噪比，有利于檢測微弱信號，如應(yīng)用TSA系統(tǒng)( tyramide signal amplification )能將雜交信號再放大 1000 倍，可用于單拷貝基因 的定位。 FISH分辨率大約為 1-3Mb, 如果應(yīng)用強(qiáng)變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙 DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達(dá)1-2kb 。還可采用對分裂中期染色體進(jìn)行顯微解剖( microdissect )法以提高分辨率。 FISH 的另一個特點是 可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng)， 在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上 的位置及探針間的相互關(guān)系， 即多色 FISH 或

19、多靶 FISH。FISH 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究 中的基因擴(kuò)增、 易位重排及缺失等的檢測， 在腫瘤診斷和鑒別診斷、 預(yù)后和治療監(jiān)控等方面 都有重要意義。Klch 等于 1989 年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)( oligonucleotide primedin situ DNA synthesis,PRINS) , 并成功地用于染色體特異 衛(wèi)星 DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在 DNA聚合酶作用下， 當(dāng)引物延伸時，摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點。PRINS 技術(shù)的優(yōu)點是不需克隆基因作探針， 且由于雜交反應(yīng)在前， 標(biāo)記

20、在后， 故非特異懷背景低。 缺點是信號弱， 靈敏度低， 為克服這一制瞇， Terkelsen 等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)( repeated PRINS ) , 重復(fù)進(jìn) 行 PRINS反應(yīng)，使信號號強(qiáng)度明顯提高?；贔ISH 的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記(multicolor PRINS), 可測定二個以上靶序列在 DNA分子上的相互的位置， 且特異性比 FISH 還高。DNA序列分析( DNA sequencing ) 應(yīng)用各種突變檢測技術(shù)檢測到的基因突變，最后都需用 序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達(dá)到100。現(xiàn)在的測序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同， 其基本原理雖仍是雙脫氧終止法， 但自動化程度大為提高， 操作更 簡便， 測序時間也大大縮短。隨著 PCR技術(shù)與測序聯(lián)合使用， 不需經(jīng)過 M13亞克隆步驟，故 稱為直接測序法( direct sequencing,DS )。 DS法測序的模板主主要來源于 PCR，應(yīng)用不對 稱 PCR( asymmetric PCR )和基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測序法( genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS )等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來，PCR循環(huán)測序法的建立，使模板擴(kuò)增與同步進(jìn)行， 引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記， 使每個樣品的四個測序反 應(yīng)可在一個反應(yīng)管