SELDI技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細胞株差異蛋白的表達

1、SELDI技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細胞株差異蛋白的表達 07-08-22 16:03:00 編輯：studa20 作者：丁守怡，錢冬萌，牟文鳳，閆志勇，宋旭霞，王斌【關(guān)鍵詞】 表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜；蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞,培養(yǎng)的；差異蛋白Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hep

2、atoma cell line (HepG2),hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS), so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at t

3、he protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption, SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2, HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were

4、 captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines, in the segments from Mr 5000 to 15 000, proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes, in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells, the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10

5、 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience, high sensitivity, and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific protei

6、ns we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepat

7、oma at the level of proteins, as well as the searching of new therapeutic target sites.【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells, cultured; distinct protein【摘要】 目的： 運用表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜(SELDITOFMS) 技術(shù),檢測體外培養(yǎng)的肝癌細胞株（HepG2）,轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）與正常肝細胞株（LO2）蛋白質(zhì)的差異表達

8、，篩選肝細胞癌的標志蛋白，為進一步研究肝癌發(fā)病的蛋白質(zhì)組學機制奠定基礎(chǔ). 方法： 常規(guī)培養(yǎng)上述3種細胞，細胞狀態(tài)良好時收集細胞，裂解細胞后采用 SELDITOFMS技術(shù)用WCX2芯片檢測HepG2, HepG2.2.15, LO2細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組學的差異表達. 結(jié)果： WCX2芯片共捕獲91個蛋白，在Mr 500015 000區(qū)段，與正常肝細胞株比較，有7個蛋白質(zhì)在兩種肝癌細胞中出現(xiàn)明顯變化，其中2個蛋白在肝癌細胞中表達量增高，5個蛋白在肝癌細胞中表達量降低；另外兩種肝癌細胞株也有其各自的標志蛋白，9個蛋白分子在HepG2表達量增高，10個蛋白分子在HepG2.2.15表達量增高. 結(jié)論： SE

9、LDI蛋白芯片技術(shù)檢測可作為檢測肝癌早期生物標記的方法，它簡便，敏感性高，重復(fù)性好，本文發(fā)現(xiàn)的這些組織特異性蛋白生物標記對肝癌的早期診斷有潛在的應(yīng)用價值，對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞之間的標志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質(zhì)水平研究肝癌的發(fā)病機制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜；蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞，培養(yǎng)的；差異蛋白0引言原發(fā)性肝癌(HCC)在我國是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位. 每年有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%. 肝癌早期沒有明顯體征，多數(shù)病人確診時

10、已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對于肝癌的早期診斷，在無癥狀的人群中發(fā)現(xiàn)早期病例，對控制肝癌的病死率有現(xiàn)實的意義. 因此，研究并尋找有價值的預(yù)警肝癌的標志物，成為進一步提高肝癌臨床治療水平的關(guān)鍵. 任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會有相應(yīng)的改變，癌癥的發(fā)生是一個多基因多階段多因子的動力學過程，HCC也不例外，目前對肝癌發(fā)生機制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表達的蛋白質(zhì)水平，因此，要求對生物功能的執(zhí)行者蛋白質(zhì)進行研究.蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一個細胞或組織或一種生物體所表達的全部蛋白質(zhì)1. 蛋白質(zhì)組學（Proteomics）是蛋白質(zhì)組

11、概念的延伸，是在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的學科. 蛋白質(zhì)組學技術(shù)為研究腫瘤標志物與腫瘤進展轉(zhuǎn)移研究提供良好的技術(shù)平臺, 為研究開辟了新的手段和視角. SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來新興的一種蛋白質(zhì)組學技術(shù)，它具有簡單、快捷、靈敏等特點，可以檢測分子量在Mr 500500 000之間的蛋白或多肽，而且所需樣本體積小（0.5400 L）2-3. 我們應(yīng)用細胞裂解液裂解體外培養(yǎng)的3種細胞（LO2, HepG2, HepG2.2.15），進行了表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細胞、肝癌細胞與轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細胞的蛋白表達圖譜

12、4，發(fā)現(xiàn)了一系列（信噪比）差異表達的蛋白，為今后從血清或肝癌組織中篩選標志蛋白提供科學依據(jù).1材料與方法1.1材料正常肝細胞株（LO2）購自中科院上海細胞庫；肝癌細胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）由第四軍醫(yī)大學吳力克主任醫(yī)師贈送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性劑（CHAPS）均購自美國Sigma公司，蛋白質(zhì)芯片時間質(zhì)譜分析儀（PBSC）及WCX2（弱陽離子交換芯片）購自美國Ciphergen Biosystems公司.1.2方法1.2.1細胞總蛋白質(zhì)的提取LO2, He

13、pG2細胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，HepG2.2.15細胞另外加入終濃度200 g/L的G418,細胞長成單層后，用無菌細胞刮刀刮取細胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea, 40 g/L CHAPS, 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 L, 4劇烈震蕩30 min, 20 817 g離心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系統(tǒng)測定蛋白濃度，用裂解液調(diào)節(jié)至所有樣品濃度為2 g/L，其余上清分裝-86備用. 每種細胞收獲3次，以排除組間差別. 每份樣品至少在2個以上的同種芯片上檢測，以排除不同

14、芯片間的差異.1.2.2WCX2蛋白芯片操作步驟將芯片裝入蛋白工作平臺，每孔加入200 L結(jié)合/洗脫緩沖液（50 mmol/L NaAc, pH 4.0）預(yù)處理芯片，室溫下200 r/min振蕩5 min，棄緩沖液，重復(fù)上述操作1次. 每孔加入50 L 12稀釋的樣品，劇烈震蕩，室溫孵育1 h. 棄掉樣品，每孔用200 L結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌2次，每次震蕩5 min. 棄去孔中液體，每孔加入200 L HPLC 水，立刻甩出. 從蛋白工作平臺中取出芯片，空氣中干燥，每孔加入0.5 L EAM（SPA中加入75 L乙氰和75 L 10 mL/L三氟乙酸）重復(fù)1次. 干燥后用蛋白質(zhì)芯片閱讀機進行質(zhì)譜分析. 1.2.3數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析用加有Allinone標準分子量蛋白的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，儀器參數(shù)設(shè)置如下： 激光強度220，檢測敏感度10，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍為Mr 200010 000,最高分子量為Mr 50 000,采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，然后用Biomarker Wizard 軟件分析LO2, HepG2