痰液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)

1、痰液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（一）關(guān)鍵詞：細(xì)胞庫菌株培養(yǎng)中心atcc北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)一、檢驗(yàn)程序痰及呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序見圖341。二、檢驗(yàn)方法( 一) 顯微鏡檢查1一般細(xì)菌涂片檢查挑取標(biāo)本中膿性或帶血部分涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢，描述觀察到的細(xì)菌的染色性、形態(tài)及排列等特征，可發(fā)出初步報(bào)告。2結(jié)核分枝桿菌涂片檢查挑取標(biāo)本干酪樣或膿性部分做抗酸染色和金胺“O”熒光染色，前者用油鏡，后者用熒光顯微鏡檢查。具體操作詳見第十五章分枝桿菌屬檢驗(yàn)。3放線菌及諾卡菌涂片檢查 將痰液用生理鹽水反復(fù)洗滌數(shù)次， 挑取黃色顆粒 ( 硫黃顆粒 ) 或不透明著色斑點(diǎn)， 置玻片上并覆以蓋玻片， 輕壓后置高倍鏡下觀察。如見中央為交織

2、的菌絲， 其末端粗桿呈放線狀排列時(shí)揭去蓋玻片， 待干后做革蘭染色及抗酸染色鏡檢。14下呼吸道其他標(biāo)本檢查 支氣管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的標(biāo)本，不易受上呼吸道雜菌的污染， 涂片檢菌的意義較大。 可取離心沉淀物進(jìn)行革蘭染色與抗酸染色檢查。( 二) 培養(yǎng)和鑒定1痰培養(yǎng)標(biāo)本的前處理于痰標(biāo)本中加入一定量無菌生理鹽水，劇烈振蕩510 秒后，將沉淀于管底的膿痰小片取出，置于另一試管中， 同法再處理 2 次，可洗去痰中的正常菌群。然后向洗滌過的痰液中加入等量 pH 7. 6 的 1胰酶溶液，放置 35環(huán)境 90 分鐘，使痰液均質(zhì)化后備用。2培養(yǎng)基與培養(yǎng)環(huán)境(1) 血瓊脂平板：適用于分離多種細(xì)菌，需氧環(huán)境

3、，可分離 - 溶血性鏈球菌，葡萄球菌；置于 5CO2環(huán)境培養(yǎng)，分離肺炎鏈球菌和 - 溶血性鏈球菌。根據(jù)血瓊脂平板生長的菌落特征及鏡檢形態(tài)， 得出初步結(jié)果， 再按各類細(xì)菌特性做進(jìn)一步鑒定。(2) 巧克力色瓊脂平板：置于 5 CO2環(huán)境培養(yǎng)，常用于分離嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌等有特殊營養(yǎng)需求的細(xì)菌。(3) 中國藍(lán)瓊脂平板麥康凱平板：需氧環(huán)境培養(yǎng)，常用于分離腸桿菌科細(xì)菌。(4)TTC- 沙保弱培養(yǎng)基：需氧環(huán)境培養(yǎng)，用于分離白假絲酵母菌及其他酵母菌、諾卡菌、放線菌以及煙曲霉菌等。(5) 厭氧血平板：厭氧環(huán)境培養(yǎng)，用于培養(yǎng)厭氧菌。(6) 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基： 需氧或 5 10 CO2環(huán)境培養(yǎng)，改良羅氏培養(yǎng)

4、基、米氏 7H10培養(yǎng)基或其他合適的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌。(7) 軍團(tuán)菌專用培養(yǎng)基：置于 2 5 5. 0 CO2環(huán)境培養(yǎng)，藥用炭酵母瓊脂 (CYE)培養(yǎng)基、 F-G 瓊脂，用于培養(yǎng)軍團(tuán)菌。3標(biāo)本的培養(yǎng)(1) 普通細(xì)菌培養(yǎng)：將處理后的痰標(biāo)本接種于血瓊脂平板、中國藍(lán)瓊脂平板麥康凱平板、巧克力色瓊脂平板上，分別放入普通環(huán)境和 5 10 CO2環(huán)境中， 35培養(yǎng) 1824 小時(shí)，觀察菌落特征，并涂片進(jìn)行革蘭染色，根據(jù)菌體的2形態(tài)特點(diǎn)做進(jìn)一步鑒定。 有條件或必耍時(shí)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。 具體操作詳見第十七章厭氧性細(xì)菌檢驗(yàn)。(2) 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：將處理后的痰標(biāo)本接種于改良羅氏培養(yǎng)基或米氏7H10培養(yǎng)

5、基，置 35、 5 10CO2環(huán)境中培養(yǎng)。根據(jù)初步生長出菌落時(shí)間和是否產(chǎn)生色素等特點(diǎn)，加以判定。(3) 標(biāo)本的菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)：液體標(biāo)本，如保護(hù)性支氣管肺泡灌洗吸出液(PBAL)、氣管穿刺抽吸液 (TTA) 、保護(hù)性標(biāo)本刷洗液 (PSB)標(biāo)本或定量稀釋均質(zhì)化處理的痰標(biāo)本，可做菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)。常用的改良 Gould 法是一種半定量的方法，先將平皿分為 A、等 4 個(gè)區(qū)，阻 3mm接種環(huán)取一滿環(huán)液化痰液 ( 或定量采集的 PBAL、TTA、PSB)接種于血瓊脂平板或巧克力色瓊脂平板，先在 A 區(qū)畫線 2040 條，然后在、區(qū)分別畫線 4 條。在做、分區(qū)畫線前，接種環(huán)均須經(jīng)燒灼滅菌。接種后的培養(yǎng)基置 35

6、培養(yǎng) 1 8 20 小時(shí)，然后分別計(jì)數(shù)各區(qū)某一特征的菌落數(shù)，查閱表 34 3 即得出每毫升痰液中某一特征菌落細(xì)菌的對應(yīng)數(shù)量。一般認(rèn)為痰液標(biāo)本中，某種細(xì)菌濃度達(dá)到 107CFUml，可視為病原菌；<104，可視為污染菌； 若介于 105106CFUml 兩者之間時(shí)，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次阻上，仍為 105106CFUml 時(shí)，亦認(rèn)為是病原菌。例如：一份痰標(biāo)本，經(jīng)均質(zhì)化處理過程已經(jīng)進(jìn)行了 1：16 倍稀釋，按上述菌落計(jì)數(shù)方法操作，培養(yǎng) 24 小時(shí)后，某一特征最優(yōu)勢菌落區(qū)生長 5 個(gè)( 相當(dāng)于 90 個(gè)) ，查表對應(yīng)于 10000 行，計(jì)算 ( ×103 ) 得菌落數(shù) 107CFU/ml，由此可以判斷該特征菌落為病原菌。 提倡做菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)有兩方面原因， 其一，有的標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量可能較少， 需