第7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征

1、第 7章蛋白質(zhì)的分離純化和表征第七章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征第一節(jié)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)每個(gè)解離基團(tuán)的 pK 值與游離氨基酸的不完全相同。等電點(diǎn)應(yīng)通過(guò)等 電點(diǎn)聚焦和其他方法來(lái)確定。第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的大小和形狀 首先，根據(jù)化學(xué)成分確定最低相對(duì)分子質(zhì)量 假設(shè)只有一種微量組分，在測(cè)量其百分含量后，可以用比例公式計(jì)算 出最低相對(duì)分子質(zhì)量。如果測(cè)量?jī)煞N痕量組分的百分比含量， 并且通 過(guò)比例公式計(jì)算的最低相對(duì)分子質(zhì)量不同， 則可以計(jì)算兩種最低相對(duì) 分子質(zhì)量的近似值的最小公倍數(shù)。實(shí)施例:純酶含有1.65%亮氨酸(MR 131)和2.48%異亮氨酸(MR 131), 以找到最低的相對(duì)分子質(zhì)量。解決方案:根據(jù) Leu

2、 的百分比，最低 Mr x1: x1 = (100'131)/1.65 = 7939.4。最低X2先生:X2 = (100 ' 131)/2.48 = 528是3艮據(jù)lie的百分比含量計(jì)算的。由于 X1 和 X2 數(shù)之間的巨大差異，建議該酶包含一個(gè)以上的 Leu 和l i e 。為了估計(jì) Leu 和 lie 的數(shù)量，首先計(jì)算 :X1/X2=7939.4/5282.31.5 .該酶含有的任何氨基酸的數(shù)量應(yīng)為整數(shù)， 表明該酶至少含有 2個(gè) Leu 和3個(gè)Ile ,其最小相對(duì)分子質(zhì)量為7939.42=15878.8或5282.3 3=15846.9二、滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量三、沉降

3、分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量基本原則 :(a)離心力(Fc)當(dāng)粒子 (生物大分子或細(xì)胞器 )在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力時(shí)，離心力“ FC由以下公式定義:f = m a = m w 2ra-粒子旋轉(zhuǎn)加速度，m-沉降粒子的有效質(zhì)量，w粒子旋轉(zhuǎn)角速度，r- 粒子旋轉(zhuǎn)半徑 (cm)。相對(duì)離心力 (RCF) 由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或離心管到轉(zhuǎn)軸中心的距離不同， 離心力 也不同。因此，文獻(xiàn)中常用 相對(duì)離心力”或 數(shù)Xg來(lái)表示離心力。只 要 RCF 值不變，樣品在不同的離心機(jī)上可以獲得相同的結(jié)果。RCF 是轉(zhuǎn)換成重力加速度的實(shí)際離心力場(chǎng)的倍數(shù)。x 是離心轉(zhuǎn)子的徑向距離，單位為厘米。 g 是地球的重力加速度 (980

4、 厘米/秒2); n是轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)，縮寫(xiě)為r/min或rpm。(3) 沉降系數(shù)根據(jù) Svedberg 1924 年對(duì)沉降系數(shù)的定義，單位離心力場(chǎng)中顆粒運(yùn)動(dòng) 的速度。X1:離心前顆粒與旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2:離心顆粒離旋轉(zhuǎn)軸的距離。通常 是 10-13秒，所以沉降系數(shù) 1 0- 1 3秒被稱為斯維德伯格單位，縮寫(xiě)為 S,維數(shù)為秒。例如，動(dòng)物原生質(zhì)體核糖體的沉降系數(shù)等于80S,即80X10-13S。細(xì)胞及其組分的沉降系數(shù)差異很大，因此可以根據(jù)生物樣品中沉降系數(shù) 的差異，通過(guò)離心作用將它們彼此分離。(4) 沉降速度對(duì)于球形粒子 :fc = 1/6 n D3( p p) 3 2X ff = 3 n d

5、v當(dāng) Fc二Ff 時(shí)，1/6 n D3 ( pp? p m)w 2X= 3w dv.v=(1/18 n )d2( ?pp pm)32X(5) 沉降系數(shù)與物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)斯維德伯格公式，沉降系數(shù)可以計(jì)算物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量:Mr二RTSXXXX , O Farrel等人根據(jù)不同生物分子之間等電點(diǎn)和相 對(duì)分子質(zhì)量的不同特點(diǎn)，建立了第一方向?yàn)镮EF-聚丙烯酰胺凝膠電泳，第二方向?yàn)槭榛蛩徕c -聚丙烯酰胺凝膠電泳的雙向分離技 術(shù)，簡(jiǎn)稱IEF/十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；基本原理與IEF-佩奇和SDS-佩奇完全相同。通常，第一方向的IEF- 佩奇使用超薄水平板，并且在電泳完成后，切割所需

6、的泳道以用于第 二方向的電泳，或者在 1毫米的內(nèi)徑處在毛細(xì)管中進(jìn)行第一次IEF-聚丙烯酰胺凝膠電泳，取出橡膠條進(jìn)行第 二次電泳。第一種電泳方法與IEF-聚丙烯酰胺凝膠電泳相同，只是在 制備膠時(shí)應(yīng)加入 2%的兩性電解質(zhì)和 6mol/L 尿素。在第二方向電泳中， SDS-PAG被傾倒在垂直玻璃板之間，在上部具有大約2厘米的空間。聚合后，第一方向膠帶被轉(zhuǎn)移到第二方向膠帶。 用載玻片輕輕將膠帶 壓直，加入3卩L 1%溴酚藍(lán)指示劑，用1%瓊脂糖(用電極緩沖液制備) 密封膠帶。瓊脂糖凝固后， 可以進(jìn)行電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)接近凝膠板的下 邊緣時(shí)，電泳停止。在第二次電泳中，使用梯度混合器將凝膠制成 7.5%-15%

7、的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。技術(shù)。具有特異性和可逆親和力的生物分子成對(duì)匹配。主要有 : 酶和底物、 酶和競(jìng)爭(zhēng)抑制劑、 酶和輔酶、抗原和抗體、脫氧核糖核酸和核糖核酸、 激素及其受體、脫氧核糖核酸和結(jié)合蛋白等。在成對(duì)的生物分子中， 它們中的任何一個(gè)都可以用作固定相， 而樣品溶液中的另一個(gè)分子可 以進(jìn)行親和層析以達(dá)到分離和純化的目的。 例如，酶和輔酶成對(duì)配對(duì)。 輔酶可用作固定相來(lái)分離和純化樣品中的酶， 或酶可用作固定相來(lái)分 離和純化樣品中的輔酶。六、高效液相色譜和快速蛋白質(zhì)液相色譜 高效液相色譜，又稱高壓液相色譜、高速液相色譜和現(xiàn)代液相色譜， 是在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分析技

8、術(shù)。 它特別 適用于高沸點(diǎn)、 不氣化或熱穩(wěn)定性差的有機(jī)物的分離和分析， 在生物 化學(xué)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。高效液相色譜在高壓下使液體通過(guò)色譜柱，在室溫下分離混合組分， 通過(guò)檢測(cè)器將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)， 并通過(guò)記錄儀跟蹤或數(shù)據(jù)處理裝置顯 示測(cè)量結(jié)果。它具有高壓、高速、高效率和高靈敏度的特點(diǎn)。(a)咼壓由于高效液相色譜使用液體作為流動(dòng)相， 并且液體在通過(guò)色譜柱時(shí)比氣體更有抵抗力，因此有必要施加高壓，通常為 15-30兆帕，最高 50 兆帕。(2) 高速 由于高效液相色譜采用高壓， 流動(dòng)相液體流速加快， 一般分析周期為 幾分鐘至 10 分鐘，比經(jīng)典的液相柱色譜快得多， 但比氣相色譜稍慢。(3) 高效率由于高效液相色譜的高柱效 (每米塔板數(shù)可達(dá) 5000)，有時(shí)一個(gè)柱可以 分離幾十個(gè)甚至幾百個(gè)組分。(4) 高靈敏度利用靈敏的探測(cè)器和自動(dòng)裝置，可以探測(cè)到10-9g甚至10-11g的物質(zhì)。 所需的樣本量非常少， 通常只需要幾十微升的樣本就可以進(jìn)行全面分 析。由于上述特點(diǎn)， 高效液相色譜自 20 世紀(jì) 70 年代以來(lái)發(fā)展迅速。 人們 普遍認(rèn)為， 當(dāng)有機(jī)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較低且沸點(diǎn)較低時(shí)， 氣相色譜 可以用來(lái)分析有機(jī)物質(zhì)。當(dāng)沸點(diǎn)較高(> 450°C)、不能蒸發(fā)或熱穩(wěn)定性 差時(shí)，可以使用高效液相色譜分析。如果條件不允許，不能購(gòu)買昂貴 的儀器，可以