第2章細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

1、第二章細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)第二章細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)1 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) 掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光可見(jiàn)光（或紫外線紫外線）為光源。電子顯微鏡電子顯微鏡：以電子束電子束為光源。1. 構(gòu)成：構(gòu)成： 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置機(jī)械裝置2. 原理：原理： 經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。經(jīng)目鏡進(jìn)一

2、步放大成像。（一）普通光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡1.物鏡轉(zhuǎn)換器 2.接物鏡 3.游標(biāo)卡尺 4.載物臺(tái) 5.聚光器 6.彩虹光闌 7.光源 8.鏡座 9.電源開(kāi)關(guān) 10.光源滑動(dòng)變阻器 11.粗調(diào)螺12.微調(diào)螺旋 13.鏡臂 14.鏡筒 15.目鏡 16.標(biāo)本移動(dòng)螺旋3. 分辨率分辨率：指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。 分辨距離越小，則分辨能力越高。分辨距離越小，則分辨能力越高。R=0.61/NA為入射光線波長(zhǎng)；為入射光線波長(zhǎng)；NA（鏡口率）（鏡口率） sin/2，n=介質(zhì)折射率；=物鏡鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角） 。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？如何提高顯微鏡的分辨能力？NA：顯微鏡物鏡

3、的鏡口率鏡口率光學(xué)性能指標(biāo)，每個(gè)物鏡上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。幾種介質(zhì)的折射率幾種介質(zhì)的折射率物鏡鏡口率受入射鏡口角入射鏡口角和介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率的限制，不可能有更大提高。所以科學(xué)家們從另外兩個(gè)途徑來(lái)改進(jìn)改進(jìn)顯微鏡：換用短波長(zhǎng)的換用短波長(zhǎng)的“照明光源照明光源”，來(lái)提高分辨能力。如：紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)，應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)反差，來(lái)提高分辨能力。（二）熒光顯微鏡（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特點(diǎn)：光源為紫外線光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨能力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式落射式。（二）熒光顯微鏡（

4、二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope原理：原理：以紫外光為光源，使被檢材料中的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析。熒光現(xiàn)象有兩種：（）自發(fā)熒光：（）自發(fā)熒光：細(xì)胞內(nèi)某些天然熒光物質(zhì)天然熒光物質(zhì)被紫外光照射所激發(fā)的熒光，例如葉綠素葉綠素（血紅色自發(fā)熒光）；（）誘發(fā)熒光：（）誘發(fā)熒光：在細(xì)胞中加入熒光染料（熒熒光染料（熒光素）光素），與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在一起，經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光。 例：熒光染料例：熒光染料吖啶橙吖啶橙，可使RNA發(fā)出紅色熒光，而使DNA發(fā)出綠色熒光。熒光顯微鏡與普通光鏡在結(jié)構(gòu)上不同之處：熒光顯微鏡與普通光鏡在結(jié)構(gòu)上不同之處

5、：（1）紫外光發(fā)生裝置紫外光發(fā)生裝置：高壓汞燈：高壓汞燈+激發(fā)裝置激發(fā)裝置+濾光濾光裝置；裝置；（2）透鏡由石英玻璃制成透鏡由石英玻璃制成，以便減少光通路上的紫，以便減少光通路上的紫外光損耗；外光損耗；（3）目鏡中要裝壓紫濾片目鏡中要裝壓紫濾片F(xiàn)luorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡（三）相差顯微鏡原理：原理：光波的三個(gè)光學(xué)特性：光波的三個(gè)光學(xué)特性：（1）波長(zhǎng)波長(zhǎng)：對(duì)于光波波長(zhǎng)變化，肉眼覺(jué)察為顏色變化

6、顏色變化;（2）振幅振幅：對(duì)于光波振幅變化（即振幅差），肉眼覺(jué)察為明暗變化明暗變化；（3）相位：相位：指某一時(shí)刻，光在其前進(jìn)路線上的位置。對(duì)于光相位的變化（即相位差），肉眼不能覺(jué)察肉眼不能覺(jué)察。當(dāng)光線穿過(guò)當(dāng)光線穿過(guò)無(wú)色透明無(wú)色透明且且非勻質(zhì)非勻質(zhì)的活細(xì)胞，其波的活細(xì)胞，其波長(zhǎng)和振幅都無(wú)明顯變化，長(zhǎng)和振幅都無(wú)明顯變化，僅光相位出現(xiàn)一定程僅光相位出現(xiàn)一定程度變化度變化。觀察時(shí)感覺(jué)觀察時(shí)感覺(jué)反差較小反差較小，物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨。，物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨。為何普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞？為何普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞？把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差光程差變成變成振幅差振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比

7、度。在構(gòu)造上，相差顯微鏡的兩個(gè)特殊之處。 環(huán)形光闌環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。作用：作用：使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。1.相差板相差板（annular phaseplate）：物鏡后加了涂有氟化鎂的相差板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。相相 差差 顯顯 微微 鏡鏡 原原 理理相差顯微鏡卻是運(yùn)用一些特殊裝置，使通過(guò)被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使人為地使這這兩組兩組光波之間微弱的相位差加大，光波之間微弱的相位差加大，再經(jīng)過(guò)光波光波干涉干涉作用，使看不見(jiàn)的相位差轉(zhuǎn)變成可見(jiàn)的振相位

8、差轉(zhuǎn)變成可見(jiàn)的振幅差幅差，從而反差增強(qiáng)反差增強(qiáng)，便能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)了。相差顯微鏡下的樣品不需染色，相差顯微鏡下的樣品不需染色，可以清晰觀察活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。相相 差差 顯顯 微微 鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本鏡用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM不同光線的波長(zhǎng)不同光線的波長(zhǎng)以電子束作光源電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。由電子束照明系統(tǒng)電子束照明系統(tǒng)、電磁透

9、鏡成像系統(tǒng)電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)、記錄記錄系統(tǒng)系統(tǒng)等部分構(gòu)成。分辨率分辨率0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2m、光學(xué) 顯 微 鏡 下 無(wú) 法 看 清 的 結(jié) 構(gòu) ， 又 稱 亞 顯 微 結(jié) 構(gòu)（submicroscopic structures）。（1）照明光源不同。照明光源不同。（2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。 依靠改變磁透鏡的激磁電流強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)放大倍數(shù)。電流強(qiáng)度的變化引起了磁場(chǎng)強(qiáng)度的改電流強(qiáng)度的變化引起了磁場(chǎng)強(qiáng)度的改變變，而磁場(chǎng)強(qiáng)度的變化又使電子射線的折射程使電子射線的折射程度發(fā)生改變

10、度發(fā)生改變，放大倍數(shù)隨之出現(xiàn)變化放大倍數(shù)隨之出現(xiàn)變化。（3）具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。 電子流的發(fā)射速度及波長(zhǎng)皆取決于電壓的高低。透射電子顯微鏡特點(diǎn)透射電子顯微鏡特點(diǎn)（4）高度真空的工作系統(tǒng)。高度真空的工作系統(tǒng)。 高速運(yùn)動(dòng)的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞，就會(huì)改變它的發(fā)射方改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊向，導(dǎo)致成像模糊。 要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，并且樣品都必須脫水。 因此說(shuō)，透射電鏡不能用來(lái)觀察活透射電鏡不能用來(lái)觀察活的樣品。的樣品。透射電子顯微鏡特點(diǎn)透射電子顯微鏡特點(diǎn)（5）樣品厚度必須樣品厚度必須 25kr/min。第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析

11、方法細(xì)胞組分的分析方法（一）差速離心（一）差速離心 Differential centrifugation特點(diǎn)特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一介質(zhì)密度均一；速度由低向高速度由低向高，逐級(jí)離心。用途用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序沉降順序 細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體線粒體溶酶體溶酶體、過(guò)氧化物酶體過(guò)氧化物酶體微微體、高爾基體、囊泡體、高爾基體、囊泡核蛋白體核蛋白體。細(xì)胞器初步分離后，再通過(guò)密度梯度離心純化。細(xì)胞器初步分離后，再通過(guò)密度梯度離心純化。（一）差速離心（一）差速離心 Differential centrifugation（二）密度梯度離心（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一用介質(zhì)在離心管內(nèi)

12、形成一連續(xù)連續(xù)或或不連續(xù)不連續(xù)的的密度梯密度梯度度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。類型類型：速度沉降、等密度沉降。：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降、速度沉降 velocity sedimentation 用途用途：分離密度相近密度相近而大小不等大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低。原理原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)沉降系數(shù)以不同的速度沉降。2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic s

13、edimentation用途用途：分離分離密度不等密度不等的顆粒。的顆粒。特點(diǎn)特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大。原理原理：樣品各成分各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中，經(jīng)過(guò)離心，沉降到與自身密度相等的介質(zhì)沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處處，并停留在那里達(dá)到平衡。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法顯色劑顯色劑能與待測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合。通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位定位及顏色的深淺顏色的深淺，判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對(duì)含量。孚爾根反應(yīng)孚爾根反應(yīng)：特異顯示DNAPAS反應(yīng)反應(yīng)：多糖多糖米倫反

14、應(yīng)米倫反應(yīng)：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)四氧化鋨四氧化鋨、蘇丹紅蘇丹紅：不飽和脂肪酸不飽和脂肪酸、脂滴脂滴格莫瑞法（Gomori）：堿性磷酸酶堿性磷酸酶三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)：將將免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法（抗原（抗原抗體抗體特異結(jié)合）與特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用于研相結(jié)合，用于研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交原位雜交（in situ hybridization）：用）：用標(biāo)記標(biāo)記的的核酸探核酸探針針，通過(guò)分子雜交，確定特異核苷酸序列

15、在染色體，通過(guò)分子雜交，確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法。上或在細(xì)胞中的位置的方法。標(biāo)記探針?lè)椒?biāo)記探針?lè)椒?、放射性同位素標(biāo)記（顯微放射自顯影）、放射性同位素標(biāo)記（顯微放射自顯影）2、熒光素標(biāo)記（熒光顯微鏡觀察）、熒光素標(biāo)記（熒光顯微鏡觀察）3、生物素標(biāo)記、生物素標(biāo)記五、流式細(xì)胞術(shù)五、流式細(xì)胞術(shù)用途用途：對(duì)：對(duì)單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速進(jìn)行快速定量分析與分選定量分析與分選。原理原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴；單個(gè)細(xì)胞的液滴；激光束的照射下，細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢激光束的照射下，細(xì)胞

16、發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果。測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果。第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程（一）群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)（一）群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的，匯合后形成均勻的單細(xì)單細(xì)胞層胞層；克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落細(xì)

17、胞集落（克隆克隆）。）。一、細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）（一）群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primary culture）：培養(yǎng)直接來(lái)自）：培養(yǎng)直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群。動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群。傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passage）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶。移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶。 傳代細(xì)胞傳代細(xì)胞：適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下，持續(xù)傳代培：適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下，持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。養(yǎng)的細(xì)胞。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)Hela 細(xì)胞（細(xì)胞（a) 和和 CHO （b) 細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞株（cell stra

18、in）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系細(xì)胞系（cell line）：從腫瘤組織腫瘤組織培養(yǎng)培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁殖。 克隆克隆（clone）：由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致遺傳性狀一致的的細(xì)胞群細(xì)胞群。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。研究：誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。研究植物的植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化生長(zhǎng)發(fā)育、分化和變異；和變異；無(wú)性繁無(wú)性繁殖殖；制取代謝產(chǎn)物。；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。制取植物代謝產(chǎn)物。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞。：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：比較容易比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，如，如DNA；便于進(jìn)行便于進(jìn)行細(xì)胞融合細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；，形成雜交細(xì)胞；細(xì)胞壁可再生，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。細(xì)胞壁可再生，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。