苦蕎黃酮的提取分離及抗氧化活性研究

1、373工藝技術(shù)食品科學(xué)2008, Vol. 29, No. 12苦蕎黃酮的提取分離及抗氧化活性研究郭剛軍，何美瑩，鄒建云，龔加順（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南昆明）摘要：采用正交試驗(yàn)研究苦蕎黃酮提取過程中的浸提時(shí)間、乙醇濃度、料液比、浸提溫度，得到最佳的提取條件為：提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比：、浸提溫度。利用最佳提取條件對苦蕎粉進(jìn)行了苦蕎黃酮的提取分離，并進(jìn)行了純化、成分分析，得到了含量高達(dá)的高純度苦蕎黃酮。以、蘆丁為對照，研究苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物在不同濃度，不同值下對的清除能力。結(jié)果表明，苦蕎黃酮的清除的能力僅次于，大于蘆丁和蕎籽醇提物，遠(yuǎn)大

2、于蕎殼醇提物，清除的能力隨著濃度的增大而升高，在范圍內(nèi)，隨著值的增大清除的能力先降低后增大，在時(shí)最低。關(guān)鍵詞：苦蕎黃酮；正交試驗(yàn)；提取分離；抗氧化性，（，；，）：，：，：，：；中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：文章編號：（）收稿日期：作者簡介：郭剛軍（），男，助理研究員，碩士，主要從事食品加工和植物中天然產(chǎn)物提取分離與功能研究?？嗍w麥屬雙子葉蓼科（）蕎麥屬植物，又名春蕎、野蕎麥，學(xué)名韃靼蕎麥（），為一年生或多年生宿根性植物，原產(chǎn)于我國東北和西南部的四川涼山地區(qū)?？嗍w耐旱耐寒、耐酸耐脊、適應(yīng)性較強(qiáng)、生長周期短，主要分布在海拔約米左右的高寒地帶，屬于無污染的綠色食品資源?？嗍w是一種藥食兩用植物，味苦，營養(yǎng)價(jià)

3、值高，具有良好的醫(yī)療保健作用，富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、礦物質(zhì)及維生素等。而且它的是含有極為豐富的生物活性成分黃酮類化合物（）又稱生物類黃酮（），是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類化合物。一般能溶于水、乙醇、乙酸乙酯等極性溶劑中，難溶于乙醚、氯仿和苯。藥效學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察表明：黃酮作為一種功能成分，具有較明顯的降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)心血管功能、血壓、中風(fēng)等。蘆?。ǎ┯置|香苷、，是苦蕎中主要的黃酮類物質(zhì)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，蘆丁具有多方面的生理活性，可用來防治毛細(xì)血管脆性引起的腦出血、肺出血、出血性腎炎、胃炎、胃潰瘍及牙齦出血等。國外還用蘆丁制備多種蘆丁衍生物，如檞皮素、羥乙基蘆2008, Vo

4、l. 29, No. 12食品科學(xué)工藝技術(shù)374丁等。因此，開發(fā)苦蕎麥具有廣闊的市場和發(fā)展前景。本研究選用云南高寒山區(qū)苦蕎麥為原料，采用乙醇熱浸提法提取分離純化苦蕎黃酮，利用對其抗氧化活性進(jìn)行研究，為云南苦蕎的集成開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。材料與方法材料與試劑苦蕎粉、苦蕎殼、苦蕎籽昭通鶴鄉(xiāng)綠色食品有限責(zé)任公司。亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉；無水乙醇；蘆?。ǎ┏啥妓伎迫A生物技術(shù)有限公司；湖南南化化學(xué)試劑廠；（，二苯基苦肼基，）美國公司。儀器與設(shè)備可見光分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；型循環(huán)水真空泵上海亞榮生化儀器廠；型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；

5、電子天平（感量）沈陽龍騰電子有限公司。黃酮提取及分離純化黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照文獻(xiàn)、，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，最小二乘法作線性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（）與吸光度的關(guān)系曲線的回歸方程：（相關(guān)系數(shù)）?？嗍w黃酮的提取方法及得率計(jì)算準(zhǔn)確稱取苦蕎粉于三角燒瓶中，加入一定比例、一定濃度的乙醇作為提取劑，在一定的溫度下提取一定的時(shí)間，將提取液趁熱減壓抽濾，轉(zhuǎn)移并定容至容量瓶中，作為待測液。然后參照文獻(xiàn)測定，計(jì)算黃酮得率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇浸提時(shí)間（）、乙醇濃度（）、料液比（）、浸提溫度（）四個(gè)因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，以黃酮得率為考察指標(biāo)，選用（）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)來選擇最佳提取條件，因素水平表見表。

6、濾渣溶劑回收上清液離心真空干燥加乙醇溶液，充分?jǐn)嚢?，靜置，離心真空干燥上述提取工藝黃酮的提取率按下式計(jì)算：苦蕎粗黃酮重（）提取率（）×苦蕎黃酮重（）苦蕎黃酮、苦蕎粉、苦蕎籽、苦蕎殼成分分析黃酮的測定：測定方法同；蛋白質(zhì)的測定：考馬斯亮藍(lán)比色法，標(biāo)準(zhǔn)溶液為牛血清蛋白，參照文獻(xiàn)，重復(fù)測定三次；氨基酸的測定：茚三酮比色法，參照文獻(xiàn)，重復(fù)測定三次；總糖的測定：蒽酮硫酸比色法，標(biāo)準(zhǔn)溶液為葡萄糖，參照文獻(xiàn)，重復(fù)測定三次；脂肪的測定：索氏抽提法，參照文獻(xiàn)，重復(fù)測定三次；灰分的測定：參照文獻(xiàn)，重復(fù)測定三次；水分的測定：參照文獻(xiàn)；重復(fù)測定三次?？嗍w黃酮抗氧化能力的測定貯備液的配制準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用無水

7、乙醇溶解，轉(zhuǎn)入的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻得濃度為的貯備液，置于冰箱中備用?？嗍w黃酮抗氧化能力的測定在試管中依次加入的溶液和濃度均為的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼醇提取液以及苦蕎籽醇提取液，混勻后靜置，用比色皿在波長處測定吸光度，并記為；加入的溶液用比色皿在波長處測定吸光度，測定值標(biāo)記為。按下式計(jì)算自由基清除率。清除率（）×不同濃度下不同物質(zhì)的抗氧化能力的測定在預(yù)先加入了溶液的試管中分別加入濃度梯度為、的標(biāo)準(zhǔn)溶液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼浸提液、苦蕎籽提取液，其余步驟同，計(jì)算其清除率。不同值條件下各物質(zhì)的抗氧化能力的測定將苦蕎黃酮溶液、苦蕎殼浸提液

8、、苦蕎籽提取液、抗壞血酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣液的值分別調(diào)至、六個(gè)梯度，再按的方法進(jìn)行測定，計(jì)算其清除率。水平因素浸提時(shí)間（）乙醇濃度（）料液比（）溫度（）：表苦蕎中黃酮提取方法因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on flavonoidsextraction from tartary buckwheat苦蕎黃酮的提取工藝375工藝技術(shù)食品科學(xué)2008, Vol. 29, No. 12試驗(yàn)號黃酮得率（）（）（）（：）（）（）（：）（）（）（：）（）（）（）較好水平表苦蕎黃酮提取的L 9(34正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of

9、 L9(34orthogonal test on flavonoids extractionfrom tartary buckwheat 黃酮樣品吸光度純度（）苦蕎粗黃酮苦蕎黃酮表苦蕎黃酮的純度表Table 3 Purification results of flavonoids extract from tartarybuckwheat樣品黃酮蛋白質(zhì)氨基酸總糖脂肪灰分水分（）（）（）（）（）（）（）苦蕎黃酮苦蕎粉苦蕎殼苦蕎籽表苦蕎黃酮、苦蕎粉、苦蕎籽、苦蕎殼成分Table 4 Ingredients of flavonoids extract of tartary buckwheat,tar

10、tary buckwheat powder and tartary buckwheat hull圖、苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的對DPPH 的清除能力比較Fig.1 Comparison among scavening capacities of flavonoids oftartary buckwheat, ethanol extract of tartary buckwheat powder andethanol extract of tartary buckwheat hull to DPPHfree radical清除率（）苦蕎黃酮蘆丁蕎籽醇蕎殼醇樣品提物提物結(jié)果與分析苦蕎黃酮的

11、最佳提取條件由表可以看出，四種考察因素對苦蕎中黃酮類化合物提取效果影響程度不同，其影響的主次順序依次為液料比乙醇濃度浸提溫度浸提時(shí)間，最佳的提取條件為，即料液比：、乙醇濃度、浸提溫度、提取時(shí)間。苦蕎黃酮的提取苦蕎粉黃酮提取通過提取工藝，按照最佳提取條件提取得到的苦蕎黃酮及經(jīng)過純化后的純度如表，提取率為。由表可以看出，所提取的黃酮不僅純度相對較高，而且營養(yǎng)也十分豐富，可以加工成很多保健食品，也可以作為保健食品的配料。在苦蕎粉、苦蕎籽、苦蕎殼中，苦蕎粉黃酮含量較高，苦蕎籽次之，苦蕎殼含量最低，在工業(yè)化提取分離黃酮時(shí)，可以直接選用苦蕎籽來作為原料，不僅可以節(jié)省脫殼的工序，而且可以節(jié)省時(shí)間和成本?？嗍w

12、黃酮抗氧化性能苦蕎黃酮、蕎籽醇提液、蕎殼醇提液的對的清除能力比較根據(jù)的測定方法進(jìn)行的清除能力的測定。依據(jù)在可見光區(qū)最大吸收峰波長為，其乙醇溶液呈深紫色，當(dāng)具有生物活性的物質(zhì)存在時(shí)，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因此可用分光光度法進(jìn)行定量分析來檢測自由基的清除情況，從而評價(jià)某種物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)?？嗍w黃酮及蕎籽醇提物、蕎殼醇提物對的清除能力見圖。本提取工藝設(shè)備要求簡單、投資少、提取率較高、提取溶劑可以循環(huán)利用，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。能快速大量的生產(chǎn)出純度相對較高的黃酮，是一條較好的提取生產(chǎn)路線?？嗍w黃酮、苦蕎粉

13、、苦蕎籽、苦蕎殼成分測定從圖可看出，所提取的苦蕎黃酮對的清除能力較強(qiáng)，僅次于，強(qiáng)于蘆丁和苦蕎籽醇提物，遠(yuǎn)大于苦蕎殼醇提取物。從對的清除能力可以看出，苦蕎黃酮的主要成分為蘆丁，這與文獻(xiàn)中的報(bào)道一致，所提取的苦蕎黃酮中，除含有蘆丁外，可能還含有少量其他的抗氧化活性較高的黃酮類物質(zhì)，使得苦蕎黃酮的清除的能力稍大于蘆丁。2008, Vol. 29, No. 12食品科學(xué)工藝技術(shù)376圖不同濃度、苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物對DPPH 的清除能力比較Fig.2 Comparison among scavenging capacities of VC, fla-vonoids of tartary b

14、uckwheat ethanol extract of tartary buckwheatpowder and ethanol extract of tartary buckwheat hull for DPPHat differents concentration清除率（）苦蕎黃酮蘆丁蕎籽醇蕎殼醇提物提物圖不同值條件下、苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物液對DP PH 的清除能力比較Fig.3 Compasion among scavenging capacities of VC flovonidsof tartary buckwheat, ethanol extract of tartary

15、 buckwheat powderand ethanol extract of tartary buckwheat hull to DPPHatdifferent pH values清除率（）苦蕎黃酮蕎籽醇提物蕎殼醇提物不同濃度苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的對的清除能力比較根據(jù)的方法進(jìn)行了苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物對的清除能力的測定，清除率隨濃度變化而變化的情況如圖所示。由圖可以看出，隨著樣液濃度的增加，、蘆丁、苦蕎黃酮、蕎籽醇提物、蕎殼醇提物對自由基的清除能力增加。蕎籽醇提物、蕎殼醇提物的提取液由于黃酮含量低，對自由基的清除能力較弱，使得對的清除能力隨著濃度增加而增加得較為明顯。而

16、提取的苦蕎黃酮和、蘆丁標(biāo)樣相同，純度較高，清除的能力較強(qiáng)，使得在濃度增加到時(shí)，即達(dá)到最大清除率以上時(shí)再繼續(xù)增加濃度，清除效果增加不明顯。不同值條件下各抗氧化劑對自由基的清除率在中性時(shí)，清除的能力達(dá)到最低。這可能是由于苦蕎黃酮的成分主要是蘆丁，蘆丁屬于黃酮苷類物質(zhì)，在不同值條件下水解程度、溶解性不同所致。結(jié)論通過正交試驗(yàn)得出乙醇熱浸提法提取黃酮的最佳條件為：料液比：，乙醇濃度，浸提溫度，提取時(shí)間，黃酮得率。提取得到的苦蕎粗黃酮純度為，純化后純度達(dá)到。從標(biāo)準(zhǔn)樣、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣、黃酮、蕎殼醇提物、蕎籽醇提物對清除能力看，苦蕎黃酮的抗氧化能力僅次于，大于蘆丁與蕎籽醇提物，遠(yuǎn)大于蕎殼醇提物。抗氧化能力隨著濃

17、度的增大而增強(qiáng)，在濃度達(dá)到即接近最大抗氧化效果。值不同時(shí)，抗氧化能力不同，酸性抗氧化能力較強(qiáng)，值為時(shí)最弱。討論苦蕎是具有保健作用的植物，但就其含有生物活性物質(zhì)黃酮及清除自由基的抗氧化活性來看，苦蕎粉和苦蕎籽粉的生物學(xué)價(jià)值顯著大于苦蕎殼。而從相同濃度的抗氧化活性物質(zhì)清除自由基及不同濃度清除自由基的變化規(guī)律來看，苦蕎黃酮清除自由基的能力及變化規(guī)律和蘆丁基本相同，從而可以推測苦蕎黃酮中含有的主要是蘆丁。但除蘆丁外，還可能含有少量活性較強(qiáng)的黃酮類物質(zhì)，對此還有待于進(jìn)一步研究。在不同值的條件下，苦蕎黃酮在酸性時(shí)的清除自由基的能力較大，甚至大于，因此建議在開發(fā)保健品時(shí)，盡可能在酸性條件下使用。參考文獻(xiàn)：郎

18、桂?？嗍w麥營養(yǎng)價(jià)值及其開發(fā)應(yīng)用中國糧油學(xué)報(bào)，（）：祁學(xué)忠，吉鎖興，王曉燕，等苦蕎黃酮及其降血糖作用的研究科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，（）：，：韓淑英，呂華，朱麗莎，等蕎麥種子總黃酮降血脂、血糖及抗脂質(zhì)過氧化作用的研究中國藥理通報(bào)，（）：歐陽平，張高勇類黃酮提取的基本原理影響因素和傳統(tǒng)方法中國食品添加劑，（）：徐寶才，丁霄霖苦蕎黃酮的測定方法無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，（）：歐陽平，張高勇，康保安，等物料預(yù)處理對苦蕎麥中總黃酮提取的影響糧油加工與食品機(jī)械，：李建武，余瑞元，袁明秀，等生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法北京：北京大學(xué)出版社，張惟杰糖復(fù)合物生化研究技術(shù)杭州：浙江大學(xué)出版社，徐昆龍，肖蓉實(shí)用動(dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)昆明：云南科技出版社，李丹，肖剛，丁