crispr cas9進行全基因組的篩選

1、Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello)一、 lentiCas9-Blast質(zhì)粒的基本信息：/pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/由于cas9自待的抗性基因是我們不需要，在抗性基因兩邊突變出酶切位點，酶切掉原本的抗性基因。換成另一種。1. lentiCas9-Blast質(zhì)粒購買來時是以細(xì)菌的形式存在的,先需要擴大培養(yǎng)。2. 試劑盒提取質(zhì)粒，并測定濃度。二、 慢病毒包裝質(zhì)粒1 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞，調(diào)整

2、細(xì)胞為7*105在5ml的DMEM培養(yǎng)基中。37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達70%80%時即可用于轉(zhuǎn)染。2 轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3 向離心管中加入質(zhì)粒DNA和等體積的Opti-MEM，混勻，調(diào)整總體積為 2.5 ml，在室溫下溫育5分鐘。4 將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100 l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。5 把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合。6 混合后，在室溫

3、下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7 DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 , 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。9 每瓶細(xì)胞中加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml，于37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。10 收集轉(zhuǎn)染后48小時（轉(zhuǎn)染即可為0小時計起）的293T細(xì)胞上清液。11 于4 ，4000 g 離心10 min，除去細(xì)胞碎片。12

4、以0.45 m濾器過濾上清液于15ml 離心管中。三、 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞參考網(wǎng)址：/protocols/generating-stable-cell-lines/1. 取六孔板鋪50000個細(xì)胞， 37°C, 5% CO 2 培養(yǎng)，待細(xì)胞長到70%，換含有8ug/ml polybrene的培養(yǎng)基培養(yǎng)。2. 慢病毒懸液用含有10ug/ml的DMEM培養(yǎng)基稀釋。3. 六孔板中每個空加一種濃度的病毒稀釋液，每空0.5ml。4. 孵育4872小時。5. 換成含有適宜濃度的抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)1.5ml，篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

5、抗生素濃度的摸索:用培養(yǎng)基稀釋抗生素為1ug/ml、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀釋后的濃度培養(yǎng)細(xì)胞，35天內(nèi)使所有細(xì)胞死亡的最低濃度可用于篩選細(xì)胞。6. 持續(xù)加藥篩選直到細(xì)胞不再大量，并能穩(wěn)定表達Cas9。一般篩選需要12個星期。7. 在轉(zhuǎn)導(dǎo)sgRNA文庫前27天改用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。（或者先測定MOI值后，根據(jù)MOI加病毒的量，操作可參照sgRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)）四、 檢測病毒轉(zhuǎn)染的結(jié)果1. 試劑盒提取質(zhì)粒2. PCR擴增（/cms/

6、filer_public/61/16/611619f4-0926-4a07-b5c7-e286a8ecf7f5/broadgpp-sequencing-protocol.pdf）。引物：Forward Primer: dCas9-F2 CCAAAGAGGTGCTGGACGReverse Primer: Blast-R GCTCTTTCAATGAGGGTGGA3. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用試劑盒純化PCR產(chǎn)物4. 通過免疫印跡擴增，收集，裂解并測試Cas9表達的細(xì)胞群。五、 lentiGuide-Puro骨架基本信息六、 SgRNA library的設(shè)計:在基因芯片上合成核苷酸，分離出來后，

7、進行PCR擴增。七、 把設(shè)計好的sgRNA整合到質(zhì)粒上：/data/plasmids/52/52963/52963-attachment_IPB7ZL_hJcbm.pdfa) SgRNA文庫的構(gòu)建1， lentiGuide-Puro載體可以使用BsmBI和一對退火的寡核苷酸可以把sgRNA克隆到骨架中。 首先把5ug的lentiviralCRISPR 質(zhì)粒用BsmBI混合37度，酶切30min。2， 試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit）純化酶切的質(zhì)粒，并用EB或ddH2O溶解。3， sgRNA1和sgRNA2用T4鏈接

8、酶連接。4，反應(yīng)程序： 5， 把第三步的產(chǎn)物用無菌水或EB以1：200的比例稀釋。6， 質(zhì)粒與sgRNA的連接整合，溫室放置10min。7. 異丙醇沉淀核酸，75%乙醇洗滌后，晾干，用ddH2O溶解。8. 測質(zhì)粒DNA的濃度。八、 sgRNA文庫的擴增/cms/filer_public/56/71/5671c68a-1463-4ec8-9db5-761fae99265d/broadgpp-pdna-library-amplification.pdf質(zhì)粒轉(zhuǎn)化電感細(xì)胞試劑: 100 µL electrocompetent cells (ST

9、BL4TM, Thermo Fisher Scientific, 11635-018) 400 ng library plasmid DNA 4 electroporation cuvettes (0.1 cm gap, Bio-Rad, 165-2089) 10 mL SOC (1X SOC, New England BioLabs, B9020S) 4 bioassay plates (500 cm2, LB agar + antibiotic) 2 Maxi-preps (Qiagen HiSpeed Maxi, 12663) Biospreader (Bacti Cell Spread

10、er, VWR International, 60828-684) Electroporator (MicroPulserTM, Bio-Rad, 16521001 37度預(yù)熱SOC培養(yǎng)基15min和含有100ug/mlAMP的LB培養(yǎng)基。2 取電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒也置于冰上，同時準(zhǔn)備干凈的電擊杯于冰上預(yù)冷。 3 取400ng的質(zhì)粒加入100ul的電感細(xì)胞中，充分混勻。4 取25ul混合液把電擊杯放在電擊儀上進行電擊（1.8kv）。 5 迅速在電擊杯中加入1ml SOC培養(yǎng)液（無抗生素），然后充分混勻，移到15ml的離心管中.6 重復(fù)3次，增加SOC培養(yǎng)基到10ml。7 取兩

11、空離心管，分別加入5ml上述混合液。8 37度放置1h。9 取10ul的混合物做4個濃度梯度，每個稀釋10倍。10 每個濃度（稀釋103、104、105、106）取10ul涂布于含有100ug/mlAmp的LB培養(yǎng)基。11 倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)1618小時。12 計算電轉(zhuǎn)的效率，菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*電感細(xì)胞數(shù)。13 第二天刮取菌落接種含有50mlLB和100ug/ml Amp培養(yǎng)基的錐形瓶培養(yǎng)，搖床37度培養(yǎng)過夜。九、 檢測擴增的質(zhì)粒1. 用試劑盒提取質(zhì)粒，按說明書操作。并測濃度。2. 雙酶切質(zhì)粒3. 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析電泳后的條帶的大小。十、 慢病毒包裝質(zhì)粒1 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰

12、蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2 x 107細(xì)胞/20 ml，重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達70%80%時即可用于轉(zhuǎn)染2 轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3 向離心管中加入質(zhì)粒DNA和等體積的Opti-MEM，混勻，調(diào)整總體積為 2.5 ml，在室溫下溫育5分鐘。4 將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100 l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。5 把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipof

13、ectamine 2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合。6 混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7 DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 , 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。9 每瓶細(xì)胞中加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml，于37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。10 收集轉(zhuǎn)染后48小時（轉(zhuǎn)染即可

14、為0小時計起）的293T細(xì)胞上清液。11 于4 ，4000 g 離心10 min，除去細(xì)胞碎片。12 以0.45 m濾器過濾上清液于離心管中?；蛘撸? 用ddH2O溶解50mg的PEI，調(diào)PH為7.1，定容到50ml。2 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HEK293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1.8*107在45ml的DMEM培養(yǎng)基中。37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 取一個50ml離心管混合以下物質(zhì)：45 加入195ul的PEI試劑，常溫放置10min。6 再加入25mlDMEM。7 跟換新的培養(yǎng)基8 48h后收集上清，0.45 m濾器過濾上清液于離心管中。十一、 慢病毒文庫轉(zhuǎn)染模式

15、細(xì)胞并進行基因篩選1.測定最適的MOI(1) .測定前一天，取6孔板，每個孔加4×106個細(xì)胞，和2ml含有8ug/ml dpolybrene的培養(yǎng)基。(2) 測定病毒的濃度，準(zhǔn)備710個無菌的Ep管。在每個管中加入90 l的無血清培養(yǎng)基。 (3) 取待測定的病毒原液10 l加入到第一個管中，混勻后，取10 l加入到第二個管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。 (4) 六孔板的每孔吸取90 l培養(yǎng)基丟棄。加入90 l稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 (5) 24小時后，換成完全培養(yǎng)基2ml。小心操作，不要吹起細(xì)胞。 (6)觀察熒光感染后72小時后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和熒光情況，

16、確定細(xì)胞狀態(tài)較好且熒光數(shù)較多的孔，對應(yīng)為較適宜的MOI值。MOI=病毒量/細(xì)胞量。（確定MOI范圍a帶熒光標(biāo)簽的慢病毒：觀察熒光感染后72小時后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和熒光情況，確定細(xì)胞狀態(tài)較好且熒光數(shù)較多的孔，對應(yīng)為較適宜的MOI值。b 不帶熒光標(biāo)簽的慢病毒：通過抗性篩確定最適MOI值。慢病毒感染后72小時加入100ug/ml的AMP，培養(yǎng)3-5天，鏡下觀察，選取細(xì)胞存活率較高且細(xì)胞狀態(tài)較好的孔，對應(yīng)為較適宜的MOI值。）2. 取病毒（最適的MOI值）感染已經(jīng)穩(wěn)定表達cas9的細(xì)胞系，于37 、 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時,并同時轉(zhuǎn)導(dǎo)未導(dǎo)入Cas9的細(xì)胞做對照。3. 48h以后向細(xì)胞添加合適的選擇劑量的嘌呤霉素。嘌呤霉素濃度的摸索:用培養(yǎng)基稀釋嘌呤毒素為1ug/ml、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀釋后