胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)CIK細(xì)胞活性的影響

1、胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)CIK細(xì)胞活性的影響    作者：蒙怡, 舒雨雁, 張學(xué)榮, 宋慧, 劉海濤    【關(guān)鍵詞】 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子;,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;,細(xì)胞毒作用;,淋巴細(xì)胞增殖 摘 要 目的: 探討胎盤免疫調(diào)節(jié)因子（placental factor, PF）對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinduced killer cells, CIK)的增殖及CIK細(xì)胞殺傷活性的影響。方法: 抽取健康人新鮮血液, 誘導(dǎo)CIK細(xì)胞產(chǎn)生后, 設(shè)加入不同濃度的PFCIK組和不加PF的空白CIK組, 觀察CIK細(xì)胞

2、的增殖率和細(xì)胞毒活性的變化。結(jié)果: 與不加PF的空白CIK細(xì)胞相比較, 加不同濃度的PF組CIK細(xì)胞的增殖率和殺傷率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。結(jié)論: PF可上調(diào)節(jié)CIK細(xì)胞的生長(zhǎng)及殺傷活性, 為CIK細(xì)胞的過繼性免疫治療提供了一種新的方法。 關(guān)鍵詞胎盤免疫調(diào)節(jié)因子; 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞; 細(xì)胞毒作用; 淋巴細(xì)胞增殖 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子( placental factor, PF), 即胎盤肽, 是從健康孕婦足月分娩的胎盤中分離提取的小分子多肽及核酸為主的混合物質(zhì), 其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為38005000, 呈淡黃色透明液體1。近年臨床使用中發(fā)現(xiàn), PF 能提高機(jī)體的免疫功能,

3、具有良好的免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)作用2, 能抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗突變, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞上綿羊紅細(xì)胞受體恢復(fù), 促進(jìn)T細(xì)胞增殖、 分化和成熟并增強(qiáng)其活性。但迄今尚未有關(guān)于PF對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK細(xì)胞）功能的影響的報(bào)道, 為此, 本實(shí)驗(yàn)中探討了PF對(duì)CIK細(xì)胞增殖及殺傷活性的影響。 1 材料和方法 1.1 材料 重組人IFN和IL1為Peprotech公司產(chǎn)品。重組人IL2和抗人CD3單克隆抗體（mAb）為北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。PHA、 RPMI1640培養(yǎng)基干粉為美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品。胎牛血清和人淋巴細(xì)胞分離液為天津TBD公司產(chǎn)品。MTT購(gòu)于Sigma公司。ATP熒光發(fā)光試劑盒為北

4、京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于晶美公司。慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株（K562細(xì)胞）購(gòu)自上海細(xì)胞庫。FITC標(biāo)記的抗CD3 mAb和PE標(biāo)記的抗CD56 mAb購(gòu)自Pharmingen公司。 1.2 方法 1.2.1 PF的制備 按照劉月新等1 報(bào)道的方法稍加改進(jìn)制成。經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè), PF中蛋白質(zhì)含量為1 g/L。 1.2.2 CIK細(xì)胞的制備 抽取健康自愿者的靜脈血20 mL, 用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）, 加RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞的密度至1×109個(gè)/L, 于50 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。于當(dāng)天加入IFN（1×1

5、06 U/L）, 放置37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h。次日, 將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板培養(yǎng)中, 分別加入終濃度為100 mg/L的PHA、 3×105 U/L IL2、 133 g/L抗CD3 mAb及1×105 U/L IL1, 每3 d半量換液1次, 同時(shí)補(bǔ)加IL2至3×105 U/L。以此方法誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后, 收獲細(xì)胞, 用FITC標(biāo)記的抗CD3 mAb及PE標(biāo)記的CD56 mAb, 采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定具有CIK細(xì)胞表型特征的CD3 CD56 細(xì)胞。 1.2.3 PF對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響 將培養(yǎng)7 d的CIK細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×

6、109個(gè)/L。于96孔板中每孔加入CIK細(xì)胞懸液和不同稀釋度（12132）的PF液各100 L, 每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照孔, 置37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h, 用ATP熒光發(fā)光法測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖（ATP的熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比）。 1.2.4 CIK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè) 將培養(yǎng)7 d的CIK細(xì)胞分為A、 B兩組, A組為只加CIK細(xì)胞懸液的對(duì)照組; B組又分為5個(gè)濃度組, 在CIK細(xì)胞懸液中加入終濃度分別為14、 18、 116、 132、 164的PF。于37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h后, 分別收集A、 B組中的CIK細(xì)胞, 并調(diào)整細(xì)胞密度為2&#

7、215;109/L。另外, 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞數(shù)用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整至1×108個(gè)/L。將A、 B組中的CIK細(xì)胞分別與K562細(xì)胞混合后, 按201的效靶細(xì)胞比加入至96孔板中, 每組均設(shè)5個(gè)平行孔, 置37、 50 mL/L CO2孵育箱中培養(yǎng)12 h。每孔加入20 L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心棄上清, 每孔加入150 L DMSO, 充分混勻溶解結(jié)晶后, 用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm測(cè)定A值, 并計(jì)算CIK細(xì)胞的殺傷率（%）。殺傷率=1（實(shí)驗(yàn)組的A值單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組的A值）/單獨(dú)靶細(xì)胞組的A值×100%。   

8、0;1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS for windows 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示; 組間的差異采用多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較和兩個(gè)樣本均數(shù)的比較, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05。 2 結(jié)果 2.1 PF對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響 加不同濃度PF的CIK細(xì)胞及不加PF的CIK細(xì)胞培養(yǎng)72 h后, 不加PF的對(duì)照組ATP的熒光強(qiáng)度為498.66; 而加PF的各組在PF的濃度為116132的范圍內(nèi), ATP的熒光強(qiáng)度隨PF濃度的增加而增強(qiáng)。PF的濃度為116時(shí), ATP的熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值3945.33, 以后雖然PF的濃度增加, 但ATP的熒光強(qiáng)度卻逐漸下降,

9、 濃度在18時(shí)為2860.00, 14時(shí)為1569.33, 于12時(shí)為26400。經(jīng)對(duì)多個(gè)樣本的均數(shù)兩兩比較, 不同濃度的PF組間CIK細(xì)胞的增殖率具有顯著差異（P<0.01, 圖1）。 圖1 PF對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響（略） 2.2 不同濃度的PF對(duì)CIK細(xì)胞殺傷活性的影響 與不加PF的對(duì)照相比較, 加入不同濃度的PF的CIK細(xì)胞的殺傷率明顯增強(qiáng)（P<0.01）。PF的稀釋度為132和164時(shí), CIK細(xì)胞殺傷率較強(qiáng)（分別為空白的86.50%和83.59%）,明顯高于對(duì)照組的55.28%（P<0.01）。隨著PF稀釋度的降低, CIK細(xì)胞的殺傷率逐漸下降, 說明CIK細(xì)胞殺

10、傷活性與PF的濃度呈正相關(guān)關(guān)系（表1）。 表1 PF對(duì)CIK細(xì)胞殺傷活性的影響（略） bP<0.01 vs PF原液及14164的PF. 3 討論 PF的理化性質(zhì)與轉(zhuǎn)移因子相似, 其生物學(xué)作用也與轉(zhuǎn)移因子及胸腺肽有一定程度的相似; 但在免疫調(diào)節(jié)方面, PF的作用強(qiáng)于后兩者, 并且無毒副作用。臨床上, PF主要用于病毒性肝炎及支氣管哮喘的治療、 抗腫瘤的輔助治療。此外, 對(duì)重癥肌無力和銀屑病、 外陰營(yíng)養(yǎng)不良等機(jī)體免疫紊亂引起的疾病也有明顯療效, 因此, PF是一種非常有研究?jī)r(jià)值的免疫調(diào)節(jié)劑3。CIK細(xì)胞是一類非MHC和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞, 其主要表型為CD3 CD56 4。在

11、培養(yǎng)過程中, 多種細(xì)胞因子的刺激, 均可激活CIK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用。CIK細(xì)胞具有增殖快、 殺瘤活性高及殺瘤譜廣等特點(diǎn), 較LAK和NK細(xì)胞的殺傷活性更強(qiáng)5。ATP熒光發(fā)光法是近年發(fā)展起來的一種針對(duì)測(cè)定的細(xì)胞數(shù)可進(jìn)行較高評(píng)估的新方法6, 7。ATP法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)的原理是, ATP為活細(xì)胞最基本的能量來源, 其水平與活細(xì)胞數(shù)呈線性正相關(guān)關(guān)系。用熒光素?zé)晒馑孛冈囼?yàn)定量測(cè)定細(xì)胞中內(nèi)源性ATP 的含量時(shí), 在有氧條件下, 熒光素酶可與其底物結(jié)合后可催化ATP 轉(zhuǎn)變成ADP, 并釋放波長(zhǎng)為562 mm的熒光, 根據(jù)其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可直接反映細(xì)胞的數(shù)量。與MTT比色法相比較, ATP法更加敏感、 準(zhǔn)確、

12、 快速; 但由于試劑和儀器價(jià)格昂貴, 其在國(guó)內(nèi)使用還不夠普遍。本實(shí)驗(yàn)中, 為探討PF對(duì)CIK細(xì)胞增殖與殺傷活性的影響, 設(shè)計(jì)了不同濃度的PF組, 發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞的增殖與PF的濃度具有依賴關(guān)系。在PF的稀釋度為12132的范圍內(nèi), CIK細(xì)胞的增殖呈拋物線形, 于稀釋度為116時(shí), 達(dá)最高峰。在PF對(duì)CIK細(xì)胞殺傷活性影響方面, 發(fā)現(xiàn)加PF的各組CIK細(xì)胞殺傷率均高于不加PF的對(duì)照組, PF的稀釋度為132時(shí)殺傷率最高。關(guān)于PF影響CIK細(xì)胞的活性的作用機(jī)制尚不明確。此外, 由于PF為一種混合物, 其中發(fā)揮主要作用的成分尚未確定, 值得進(jìn)一步研究。    

13、參考文獻(xiàn): 1 劉月新, 李勛楚, 段茂芳, 等. 一種新的免疫調(diào)節(jié)劑胎盤因子的制備與研究J.    中國(guó)免疫學(xué)雜志, 1985, 5 (1): 51. 2 許代娣, 李 琪. 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子的研究現(xiàn)狀J. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 16 (2): 228-230. 3 張學(xué)榮, 舒雨雁. 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子的實(shí)驗(yàn)研究J. 廣西科學(xué), 1996, 3(4): 41-44. 4 SchmidtWolf GD, Negrin RS, Schmidt Wolf IGH. Activated T cells and cytokineinduced CD3 CD56 killer cellsJ. J Ann Hematol, 1997, 74(2): 51-56. 5 秦福麗, 張紹林. CIK細(xì)胞的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用J. 國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè), 2004, 31(11): 824-826.    6 Crouch SPM., Kozlowski R