毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離煙草中的生物堿

1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離煙草中的生物堿許慶平 何友昭*摘要 毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離煙草生物堿時(shí)，用磷酸緩沖體系未能將米渥斯明與其它生物堿分離。本文采用酒石酸緩沖體系，成功地分離了包括米渥斯明在內(nèi)的四種煙草生物堿，分離度達(dá)到1.6。該緩沖體系不僅提高了分離度，還改善了檢測(cè)靈敏度。論文還探討了陽(yáng)離子耗盡富集法在煙草微量生物堿分析中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞 毛細(xì)管區(qū)帶電泳，酒石酸，煙草，生物堿，陽(yáng)離子耗盡富集。生物堿類(lèi)化合物是煙草的重要成分，其種類(lèi)和含量不僅影響卷煙的質(zhì)量，而且會(huì)影響吸煙者的健康。煙草生物堿中煙堿（尼古?。┖孔罡?，其它生物堿的含量較低，其中有些對(duì)卷煙質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生不利影響。煙草生物堿能在煙氣中形成特有的致

2、癌亞硝胺1-3，如圖1中的NNK和NNN，所以有必要對(duì)煙草中的煙堿和其它生物堿進(jìn)行分離和測(cè)定。已報(bào)導(dǎo)的煙草生物堿分離測(cè)定方法有氣相色譜和液相色譜法。毛細(xì)管電泳具有簡(jiǎn)易、快速、高效和低成本等特點(diǎn)。煙草生物堿的毛細(xì)管電泳分離已有報(bào)導(dǎo)4, 5，該方法采用磷酸緩沖體系，用毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法分別分離了3種和5種煙草生物堿。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，磷酸緩沖體系不能將米渥斯明與其它煙草生物堿分離。本文采用酒石酸緩沖體系的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，可使4-5種煙草生物堿達(dá)到基線(xiàn)分離。不僅分離度改善，而且吸收峰增大，優(yōu)于已報(bào)導(dǎo)的方法4, 5。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器和試劑1229型毛細(xì)管電泳儀（北京新技術(shù)應(yīng)

3、用研究所），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。N-2000雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）。S-2200超聲波清洗器（35 kHz, 120 W, 上海杰理科技公司）。50 mm i.d.石英毛細(xì)管總長(zhǎng)60 cm, 有效長(zhǎng)度45 cm（河北永年銳灃色譜器件公司）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)溶液用去離子水配制（合肥科生公司）。煙堿、去甲基煙堿、假木賊堿和米渥斯明購(gòu)自Sigma (USA)。緩沖液為360 mmol/L酒石酸用5 mol/L NaOH調(diào)至pH 3.2。2.2 實(shí)驗(yàn)方法 毛細(xì)管電泳分離 每天使用前分離毛細(xì)管用下列試劑順序沖洗：1.0 mol/L鹽酸，5 min；去離子水，1 min,

4、；1.0 mol/L氫氧化鈉，15 min；去離子水，1 min；再用緩沖溶液平衡10 min。樣品分離之間用緩沖液沖洗2 min。先4 kV電動(dòng)引入水塞10 s, 再4 kV電動(dòng)進(jìn)樣50 s。電泳電壓12 kV。 樣品處理 稱(chēng)取40 烘干4 h、碾磨并過(guò)40目篩的煙葉樣品0.010 g于100 mL帶塞錐形瓶中, 加入50 mL去離子水，蓋塞超聲15 min?；旌弦航?jīng)離心, 2000 rpm, 2 min。上清液冰箱冷藏，供檢測(cè)使用。3 結(jié)果與討論3.1 電泳緩沖液的選擇采用磷酸和酒石酸緩沖體系對(duì)煙堿(nicotine)、去甲基煙堿 (nornicotine)、米喔斯明(myosmine)

5、和假木賊堿 (anabasine)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離，見(jiàn)圖2。經(jīng)分離條件優(yōu)化后，酒石酸緩沖體系不僅分離度改善，而且峰高增加。原因可能是分子間的配位作用增強(qiáng)了共軛p鍵。磷酸緩沖體系中未見(jiàn)米渥斯明的分離峰。圖2 不同緩沖體系的煙草生物堿電泳圖. Fig.2 Electropherograms of tobacco alkaloids with different buffer systems.A: pH 2.2, 100 mmol/L phosphate buffer solution. B: pH 3.2, 360 mmol/L tartaric acid buffer solution.

6、Sample solution is injected at 4 kV for 10 s, electrophoretic voltage is 12 kV. 1, 0.9 mg/L nornicotine; 2, 1.1 mg/L nicotine; 3, 0.5 mg/L myosmine and 4, 0.6 mg/L anabasine.3.2 緩沖溶液pH值對(duì)煙草生物堿分離度的影響采用360 mmol/L酒石酸緩沖溶液時(shí)，不同pH的毛細(xì)管電泳分離見(jiàn)圖4。低pH時(shí)，去甲基煙堿和煙堿的分離度較好，但米渥斯明未能基線(xiàn)分離高pH時(shí)，去甲基煙堿和煙堿不能基線(xiàn)分離。pH 3.2的分離效率和分離度

7、較佳，選定酒石酸緩沖溶液pH值為3.2。圖4 煙草生物堿在不同pH緩沖液中的電泳譜圖. Fig. 4 Electropherograms of tobacco alkaloids with different pH tartaric buffer solutions.360 mmol/L tartaric acid buffer solution Sample injection voltage is 4 kV for 30 s, electrophoretic voltage is 12 kV. 1, 0.9 mg/L nornicotine; 2, 1.1 mg/L nicotine; 3

8、, 0.5 mg/L myosmine and 4, 0.6 mg/L anabasine.3.3 酒石酸緩沖液濃度對(duì)煙草生物堿分離度的影響在pH值為3.2時(shí), 對(duì)緩沖溶液濃度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1。緩沖溶液濃度為360 mmol/L時(shí)分離度最好。緩沖溶液濃度低于360 mmol/L時(shí)，米渥斯明與假木賊堿分不開(kāi)；高于360 mmol/L時(shí)，去甲基煙堿與煙堿又不能基線(xiàn)分離。在煙草生物堿的電泳分離中，為提高緩沖容量一般選用較高濃度緩沖液，本文選360 mmol/L。3.4 樣品分析中的陽(yáng)離子耗盡富集法在煙草樣品分析中，要檢測(cè)比煙堿含量低得多的米渥斯明，必須加大進(jìn)樣量。而進(jìn)樣量增大又會(huì)降低分離度，特別是緊

9、靠煙堿的去甲基煙堿。在進(jìn)樣前加一小段適當(dāng)長(zhǎng)的水塞，具有堆積作用，即陽(yáng)離子耗盡富集法，會(huì)使分離樣品富集，譜峰更尖銳，分離度改善。固定進(jìn)水塞時(shí)間分別為0, 10, 20和30 s，考察進(jìn)樣時(shí)間20, 40和60 s對(duì)米渥斯明峰高和去甲基煙堿與煙堿之間的分離度的影響。圖5表明米渥斯明的峰高總是隨進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但隨進(jìn)水時(shí)間的變化卻有一個(gè)最佳時(shí)間 10 s。圖 5 米渥斯明的峰高隨進(jìn)水時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間的變化Fig 5 Effect of injection times of water plug and sample solution on peak height of myosmine.圖6說(shuō)明

10、去甲基煙堿與煙堿間的分離度隨進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)而降低, 進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)50 s，分離度均小于1。進(jìn)水時(shí)間有一個(gè)最佳值10 s。綜上所述，優(yōu)化后的進(jìn)水時(shí)間為10 s，進(jìn)樣時(shí)間為50 s。圖6 去甲基煙堿與煙堿之間的分離度隨進(jìn)水時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間的變化Fig. 6 Effect of injection time of water and standard solution on resolution between nornicotine and nicotine.3.5分離與定性電泳電壓也會(huì)影響實(shí)際煙草樣品的生物堿分離。由于煙堿濃度高，去甲煙堿不易與煙堿分離。電泳電壓12 kV時(shí)，可使去甲煙堿與煙堿基線(xiàn)

11、分離。在上述優(yōu)化條件下，實(shí)際樣品的分離圖譜見(jiàn)圖7。將標(biāo)準(zhǔn)峰的相對(duì)保留時(shí)間（即其它煙堿保留時(shí)間對(duì)煙堿保留時(shí)間的比值）與實(shí)際樣品峰的相對(duì)保留時(shí)間比較, 分離物即可得到確認(rèn)。圖7實(shí)際樣品的分離譜圖Fig.7 electrophorogram of tobacco sampleReferences1 Xin Huijun (辛惠君), Xie Fuwei(謝復(fù)煒), Deng Dajun(鄧大君). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化學(xué)), 2000, 48(4):436-438 2 Hecht S S. Mutation Research, 199

12、9, 424: 127-1423 Kleinsasser N H, Wallner B C, Harreus U A, Zwickenpflug W, Richter E. Toxicology, 2003, 192: 171-1774 Yang S S and Smetena I. Chromatographia., 1995, 40:375-3785 Yang S S, Smetena I, Goldsmith A I. Journal of Chromatography A, 1996, 746:131-136Abstract There has been very little pub

13、lished with respect to the separation of myosmine and other alkaloids in tobacco with capillary electrophoresis using a phosphate buffer.In this work,we have developed a new electrolyte system for the separation of the tobacco alkaloids with capillary electrophoresis. which is capable of resolving myosmine and other alkaloids in tobacco. We found a highly concentrated tartaric b