麩曲醬香酒醅中酵母菌的分離_篩選及應(yīng)用

1、高粱、小麥粉碎潤(rùn)料蒸煮糊化攤涼發(fā)酵蒸餾成品稻殼酵母曲馬榮山, 劉 婷, 郭 威( 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110161)摘 要: 以麩曲醬香型白酒酒醅為菌種來(lái)源，通過(guò)平板分離純化得到7株酵母菌。將各菌株分別制曲后測(cè)定酶活力及發(fā)酵力，篩選 出5株酶活力高、發(fā)酵力強(qiáng)的酵母菌，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定醬香酒的最佳工藝條件。結(jié)果表明，在發(fā)酵時(shí)間為21d，發(fā)酵溫度為20，曲 料比為1:1.1，接種量為13%的條件下，酒的醬香味突出，酒質(zhì)最好。詞: 麩曲；醬香；酵母菌；篩選關(guān) 鍵中圖分類(lèi)號(hào): TS 262.3 ; TS 261.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào): 0254- 5071( 2008) 01

2、- 0017- 02Isolation, screening and application of yeasts from fermented bran-koji of Maotai-flavor liquorMA Rongshan, LIU Ting, GUO Wei(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)Abstract: Using fermented bran koji of Maotai-flavor liquor as microbial sour ce, seven ye

3、asts were isolated by streak plate method. The enzyme activity and fermentation capacity were examined for each strain by koji-making, by which five excellent strains with high activity were screened. The optimal conditions for Maotai-flavor liquor production was determined by orthogonal test. The r

4、esults showed that the good liquor with typicalflavor and high quality could be produced at 20 for 21 d with 13% inoculum when the addition ratio of koji and material was 1:1.1.Key words: bran-koji; Maotai-flavor; yeast; screening以茅臺(tái)為代表的醬香型白酒，是我國(guó)五大主要香型白酒之一。其酒質(zhì)具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味 悠長(zhǎng)、空杯留香持久的風(fēng)格特點(diǎn)，深受人民群

5、眾的喜愛(ài)5。 該香型白酒為混合菌種發(fā)酵，其風(fēng)格的形成與發(fā)酵過(guò)程中 各種酵母菌的生命活動(dòng)息息相關(guān)8。本實(shí)驗(yàn)對(duì)麩曲醬香酒 醅中的酵母菌進(jìn)行了分離純化，并將各菌株分別制成酵母 曲，通過(guò)對(duì)酵母曲各指標(biāo)的測(cè)定篩選出最佳菌株；同時(shí)應(yīng) 用自制麩曲釀造醬香白酒并確定最佳工藝條件，對(duì)提高和 穩(wěn)定白酒的質(zhì)量及產(chǎn)量具有重要意義。1 材料與方法1.1 材料菌種來(lái)源：麩曲醬香型白酒酒醅（由鳳城老窖酒廠提 供）；培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基。原輔料：高粱、麩皮、稻殼。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 酵母菌分離稀釋涂布平板法和平板劃線分離法2，4，9。1.2.2 酵母菌純化在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上選取形態(tài)不同的菌落，進(jìn)一步 進(jìn)行劃線分離純

6、化，并用顯微鏡檢查純化效果。如不純，再挑單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至菌株完全純化。1.2.3 菌種保存將分離得到的酵母菌編號(hào)，并劃線于麥芽汁斜面培養(yǎng) 基上低溫保存。1.2.4 酵母曲理化指標(biāo)的測(cè)定將分離得到的菌株分別制曲后，采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定菌落總數(shù)；常壓干燥法測(cè)定水分；酸堿滴定法測(cè)定酸度；碘量法測(cè)定液化酶活力；DNS 法測(cè)定糖化酶活力；福林 -酚 法測(cè)定蛋白酶活力；CO2 失重法測(cè)定發(fā)酵力1，7。1.2.5 麩曲醬香酒發(fā)酵工藝流程101.2.6 氣相色譜條件FID 檢測(cè)器，色譜柱為 Cp-Sil 毛細(xì)管色譜柱，柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑 0.32mm，液膜厚度 0.25m，載氣 N2，載氣流量1mL/m

7、in，H2 流量 30mL/min，空氣流量 300mLmin，進(jìn)樣口 溫度 200，檢測(cè)器溫度 300，分流比 37:1，起始柱溫60， 恒溫 3min，以 3.5/min 程序升溫至 180，繼續(xù)恒溫10min。2 結(jié)果與分析2.1 酒醅中酵母菌的分離、純化從麩曲醬香型白酒酒醅中經(jīng)反復(fù)分離純化出 7 株酵 母菌，其主要形態(tài)特征見(jiàn)表 1。各酵母曲理化指標(biāo)的比較將通過(guò)對(duì)麩曲醬香酒醅中分離純化得到的 7 株酵 母菌分別制曲，編號(hào)為，并測(cè)定各理化指標(biāo)，結(jié)果 見(jiàn)表 2。由表 2 可知，各曲的水分含量均為 10%13%，這樣既保 證了菌的生長(zhǎng)和酶的生成，又避免了因水分含量過(guò)多而造 成雨季生霉。各曲的酵

8、母菌數(shù)量較多，能在釀酒過(guò)程中起到發(fā) 酵作用。但不同酵母曲的化學(xué)指標(biāo)有顯著差異，其中酸度在2.2收稿日期: 2007-07-11作者簡(jiǎn)介: 馬榮山（1961-），男，遼寧錦州人，副教授，主要從事食品發(fā)酵、生物技術(shù)、白酒、飲料及食品添加劑的研究工作。V時(shí)間/1.乙醛；2.乙酸乙酯；3.正丙醇；4.仲丁醇；5.乙縮醛；6.異丁醇；7.正丁醇；8.丁酸乙酯；9.異戊醇；10.乳酸乙酯；11.棕櫚酸乙酯；12.己酸乙酯；（以下同）圖 1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Figure 1. Chroma togra m of mixe d s ta nda rd s olution2103V9115 614 7812

9、時(shí)間/圖 2 醬香酒樣品色譜圖Figure 2. Chroma togra m of ma ota i- fla vor liquor2008 No.1S e ria l No.178C h in aBre win g·18·Research Report0.9mmol/100g1.3mmol/100g 的為一級(jí)曲，在 0.6mmol/100g0.9mmol/100g的為二級(jí)曲6，因此各曲酸度均滿足理化要 求；液化力號(hào)偏低，其余均超過(guò) 0.75mg 淀粉 （/ g·h）；糖 化力號(hào)偏低，其余均250mg 葡萄數(shù) （/ g·h）；蛋白酶活 力號(hào)偏低，其余均

10、> 400U/g；發(fā)酵力號(hào)和號(hào)偏低。綜 合考慮各指標(biāo)，選擇、號(hào)這幾株菌作為醬香 酒曲的發(fā)酵菌種。表1 7 株酵母菌的主要形態(tài)Ta ble 1. The ma in conforma tion of 7 ye a s ts果見(jiàn)表 3。感官評(píng)定得分最高的工藝條件為 A2B2C2D2，即：發(fā)酵 時(shí)間為 21d，發(fā)酵溫度為 20，曲料比為 11.5，接種量為13%。由此工藝釀造的醬香酒清亮透明，醬香突出，綿甜醇 厚，具有明顯的醬香風(fēng)格。最佳工藝條件下醬香酒的微量成分分析2.4菌株菌落特征菌體特征Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7邊緣整齊、光滑、乳白色邊緣整齊、光滑、白色 邊緣整齊、部分有皺紋、乳白色

11、邊緣波紋狀、光滑、乳白色 平滑、光亮、乳白色 無(wú)光澤、部分有皺紋、白色 邊緣波紋狀、無(wú)光澤、白色圓形圓形 橢圓形 橢圓形 圓形 橢圓形 橢圓形表2 酵母曲發(fā)酵能力的比較Ta ble 2. The compa ris on of va rious phys iologica l a nd bioche mica l inde x of ye a s t- koji水分菌落酸度/液化力/糖化力/蛋白酶發(fā)酵力曲號(hào) 含量/ 總數(shù)/ （mmol·mg淀粉·mg葡萄糖· 活力/gCO·2 （g·72h）-1% （個(gè)·g-1） 100g-1） （g

12、·h）-1（g·h）-1（U·g-1） 10.510.613.011.910.111.012.14.2×1093.2×1092.0×1092.6×1092.6×1093.7×1092.9×1091.00.780.780.780.750.750.830.682672512532762852631866826504152884765014960.6190.4610.5600.3320.5790.5830.333表3麩曲醬香酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果Ta ble 3.

13、The re s ults of orthogona l e xpe rime nts因素試驗(yàn)號(hào)感官評(píng)定（得分）A發(fā)酵溫度/B時(shí)間/dC曲料比D接種量/%123456789K1K2K3 k1 k2 k3R1（15）1（15）1（15）2（20）2（20）2（20）3（25）3（25）3（25）202.6215.8204.367.571.968.14.41（12）2（21）3（28）1（12）2（21）3（28）1（12）2（21）3（28）206.4232.3184.068.877.461.316.11（11.1）2（11.5）3（12）2（11.5）3（12）1（11.1）3（12）1（11

14、.1）2（11.5）206.8210.4205.568.91（15）2（13）3（11）3（11）1（15）2（13）2（13）3（11）1（15）209.1211.4202.267.970.578.057.270.780.065.168.374.361.7表4 醬香酒樣微量成分色譜分析結(jié)果Ta ble 4. The che oma togra ph a na lytic re s ult of micro- ingre die nt in ma ota i- fla vor liquor峰號(hào)成分保留時(shí)間/min峰高/mV峰面積/mV 含量（/ g&

15、#183;L-1）12345678910乙醛乙酸乙酯 正丙醇 仲丁醇 乙縮醛 異丁醇 正丁醇 丁酸乙酯 異戊醇 乳酸乙酯0.6981.7352.5012.7263.1913.7343.9794.4695.5426.1446.6479.7720.68516.327.2042.1141.8262.2851.0760.3874.83215.834.1830.1331.8925.965.793.061.5312.710.15141.10150.31180.08870.26280.14870.08170.37950.32461.24900.02620.3472

16、=622.711 棕櫚酸乙酯12己酸乙酯2.3 麩曲醬香白酒釀造工藝的確定以 A 發(fā)酵溫度（）、B 發(fā)酵時(shí)間（d）、C 曲料比以及 D 接種量（%）為因素，選取適當(dāng)?shù)乃竭M(jìn)行麩曲醬香酒的發(fā) 酵試驗(yàn)，并分別對(duì)各酒樣進(jìn)行了感官評(píng)定和指標(biāo)測(cè)定，結(jié)3 結(jié)論3.1 從麩曲醬香型白酒酒醅中分離出 7株酵母菌，并分別( 下轉(zhuǎn)第25頁(yè))!1412Lm CPPs0.00g/L積 10 CPPs0.02g/L/體 8總 CPPs0.10g/L液 6 CPPs0.20g/L 堿 CPPs0.60g/L 的 4耗消 2010 20 30 40 5060 70 80時(shí)間/min圖3 不同濃度CP P s III阻止鈣沉

17、淀的結(jié)果Figure 3. P re ve ntion of ca lcium de pos ition by diffe re nt conce ntra tions of CP P s2008 年 第 1 期總第 178 期中國(guó)釀造·25·研究報(bào)告濃度越高阻止鈣沉淀的能力越強(qiáng)。通過(guò)觀察0.6g/L的CPPs能在70min內(nèi)不生成鈣沉淀；0.2g/L能阻止約20min，20min 后沉淀逐漸產(chǎn)生；0 . 1g/L 的CPPs 能阻止約7min ，之后產(chǎn) 生沉淀。固定化酶的生產(chǎn)試驗(yàn)積蓄了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):1 PETERSON R F, NAUMAN L W, MCM

18、EEKIN T L. The sepa ration and amino acid composition of a pure phosphopeptone prepared from-casin by the action of trypsin J. J Amer Chem Soc, 1958（80）：95-99.2 ADAMSON N J, REYNOLDS E C. Characterization of tryptic casein phosphopeptides prepared under industrially relevant condition J. Biotech Bio

19、eng, 1995（45）：196-204.3 ONOT,OHOAWAT,TAKAGIY.Complexesofcaseinphosphopeptidesand calcium phosphate prepared from casein micelles by tryptic digestion J. Biosci Biotech Biochem, 1994, 58（8）：1376-1380.4 馬翠娥，鄭昌學(xué)，徐亦農(nóng). 高活力胰酶制備工藝的研究J. 中國(guó)生化藥 物雜志，1993（3）：11-13.5 羅 虹，周 昕. 工業(yè)胰酶生產(chǎn)工藝的研究 J. 中國(guó)生化藥物雜志，1994（15）：283

20、-284.6 相沂孝亮. 酶應(yīng)用手冊(cè)（黃文濤，胡學(xué)智譯）M. 上海：科學(xué)技術(shù)出版 社，1989：112.7 陳陶聲，居乃琥，陳石根. 固定化酶理論與應(yīng)用M. 北京：中國(guó)輕工業(yè) 出版社，1987：129.8 王秀奇，秦淑媛，高天慧，等. 基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)M. 北京：高等教育出版 社，1982.9 BERROCAL R, et al. Technical aspects of phosphorus reduction and mineral adaptation in infant formulae. Monatsschr Kinderheilkd, 1992,140（9 Suppl 1）：S51-5

21、5.10 BERROCAL R. et al. Tryptic phosphopeptides from whole casein. II.Physicochemical properties related to the solubilization of calcium J. J Dairy Res, 1989，56（3）：335-41.11 ROSHID A, et al. Nutrition: proteins and amino acids M. Tokyo：Japan Sci Press, 1990：207-220.分別使用相同濃度（0.6g/L）的CPPsI（液態(tài)酶制備的產(chǎn)物）和

22、CPPsII（I 固定化酶制備的產(chǎn)物）進(jìn)行阻止鈣沉淀 的測(cè)試，結(jié)果相似。3 結(jié)論以海藻酸鈉制備固定化胰酶，優(yōu)化了反應(yīng)條件，測(cè)定 了其特性。并對(duì)固定化胰酶水解產(chǎn)生CPPs進(jìn)行了相關(guān)分 析，取得了較好的效果，同時(shí)采用固定化酶對(duì)CPPs制備進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，固定化酶和液態(tài)酶的水解產(chǎn)物具有 相同的性質(zhì)，該試驗(yàn)所獲得的固定化酶保持了原酶的功能 和性質(zhì)，采用此方法固定化酶是可行的，并為進(jìn)一步擴(kuò)大#( 上接第18頁(yè))自制成酵母曲，從中篩選出 5 種酵母菌，尤以菌株性能為最佳，其糖化力、蛋白酶活力和發(fā)酵力都很高。3.2 采用 4 因素 3 水平正交試驗(yàn)分別確定了麩曲醬香酒 的最佳工藝條件，即：發(fā)酵時(shí)間為 21d，發(fā)酵溫度為 20， 曲料比為 1:1.5，接種量為 13%。4 胡文浪. 梅酒酵母篩選、分離、純化、選育應(yīng)用J. 釀酒科技，2002（4）：33-34.5 李 云 龍 ，馬 榮 山 ，董 靜 . 醬 香 型 白