Transwell實驗 超詳細

1、Transwell侵襲實驗總結(jié) 第一節(jié) 概念這里想明確兩個概念，一個是Transwell，另一個是腫瘤細胞侵襲模型。1.Transwell關(guān)于Transwell這個詞該如何解釋，查了很多資料也未見準確的注解，我覺得可以這么理解吧，trans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corning公司的Transwell說明書中的介紹，可以認為這是一種膜濾器（Membrane filters），也可認為是一種有通透性的支架（permeable supports）。更準確地說，Transwell應(yīng)該是一種實驗技術(shù)，這項技術(shù)的主要材

2、料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對Transwell會有不同的命名，而不同型號也可有不同形狀，不同大小，根據(jù)實驗需要，可有不同選擇。 但無論是何種外形，其關(guān)鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一張有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.112.0µm，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下圖是一個Transwell裝置的縱切面 將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)

3、稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。 應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。下面參考guxuefeng戰(zhàn)友和cosmosci戰(zhàn)友的帖子具體來談?wù)効讖降倪x擇，當然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：（1）共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能

4、力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0µm以下孔徑。常用0.4、3.0µm。我們實驗室用的是0.4µm。 將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響。（2）趨化性實驗可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的趨化作用。趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。（3）腫瘤

5、細胞遷移實驗常用8.0、12.0µm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。（4）腫瘤細胞侵襲實驗常用8.0、12.0µm膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。 上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細胞外基質(zhì)，細胞欲進入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。2.腫瘤細胞侵襲模型用于研究腫

6、瘤細胞侵襲能力的腫瘤細胞侵襲模型有如下幾種（引自司徒鎮(zhèn)強細胞培養(yǎng)）：2.1 體內(nèi)癌細胞侵襲模型2.1.1 皮下移植侵襲模型2.1.2 肌肉內(nèi)移植侵襲模型2.1.3 腹腔內(nèi)移植侵襲模型2.1.4 小鼠腎包膜下移植侵襲模型2.1.5 鼠睪丸包膜下移植侵襲模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵襲模型2.1.7 鼠爪墊皮下移植侵襲模型2.1.8 視網(wǎng)內(nèi)界膜侵襲模型2.2 體外癌細胞侵襲模型2.2.1 體外靜止器官培養(yǎng)法2.2.1.1 半固體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法2.2.1.2 液體培養(yǎng)基單細胞器官培養(yǎng)法2.2.2 半體外半體內(nèi)器官培養(yǎng)法2.2.3 單層細胞器官培養(yǎng)法2.2.4 瘤細胞球體器官培養(yǎng)法2.2.

7、4.1 靜止球體器官培養(yǎng)法2.2.4.2 旋轉(zhuǎn)搖動球體器官培養(yǎng)法2.2.5 單層細胞侵襲實驗?zāi)Ｐ?.2.6 Transwell侵襲小室測定法可見，Transwell與侵襲實驗之間并不能劃等號，Transwell有多種應(yīng)用，侵襲實驗也有多種方法。所謂Transwell侵襲實驗，其實是指將Transwell這一技術(shù)應(yīng)用于腫瘤細胞侵襲研究的一種實驗。由于其簡單易行、重復性好，因而得到了越來越廣泛的應(yīng)用，但不能認為研究腫瘤侵襲只有Transwell一種方法。第二節(jié) Transwell侵襲實驗我的課題涉及Transwell侵襲實驗和Transwell遷移實驗，其他方面的Transwell應(yīng)用我不太清楚，

8、因此這里主要談?wù)凾ranswell侵襲實驗。1.實驗用品： Transwell小室：多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實驗室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的Thincert。這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質(zhì)膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴，我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的，質(zhì)量很好，但是非常貴，24孔板配套的小室，每個價格約130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價格不清楚。Coster和C

9、orning公司生產(chǎn)的小室，是論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說每個小室成本只有40左右，應(yīng)該比較適合中國國情。下面是一些戰(zhàn)友提供的價格，具體建議大家聯(lián)系代理商咨詢。linanping1979戰(zhàn)友提供的價格：coster的24孔板的transwell的價格是456元RMB,8µm，用于腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰(zhàn)友提供的價格：Millipore的8µm的50個1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的BD價格： 240RMB一塊（6.5um,24孔,12instert），好像是沒膠的。liguofan說國產(chǎn)的boyden30塊一個

10、。jjyy提供的價格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民幣不到。平均每個20元不到。Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過其實洗洗泡泡還是可以重復用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基質(zhì)膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干凈，用前用紫外里外都照30min。sword01戰(zhàn)友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3×5min，蒸

11、餾水3×5min，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。因為我買的是鋪好膠的，所以沒買Matrigel，二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的Chemicon ECM550系列，膜很結(jié)實，擦不壞，可以反復用很多次，但現(xiàn)在的膜已經(jīng)改用一種很薄很脆的材料，一般只能重復用一次，真黑??！很多戰(zhàn)友說Costar和Corning也是可以重復用的，大家可以試試。victoh戰(zhàn)友對Millipore公司的millicell有比較詳細的講解，鏈接如下： 本人沒見過，有興趣的可以自己研究一下。另外，根據(jù)論壇戰(zhàn)友提供的信息，osmonic公司有專用的膜

12、出售，鼎國生物代理。Transwell小室用過后，可把原來的膜切下，貼上osmonic公司的膜，這樣又可以用了，不過我沒用過，有興趣的可以試試。maojianwen戰(zhàn)友的使用方法： trasnwell小室做一次后，將原來的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用無色較稀的）將osmonic公司的膜貼上，剪掉多余的邊緣。再照紫外。 上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。 細胞：值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞

13、MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。另外，為了讓實驗結(jié)果更明顯，可先撤血清讓細胞饑餓1224h，再進行實驗。 基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和型膠原，生產(chǎn)廠家有BD、美國Collaborative Rsearch公司等。CaoY戰(zhàn)友的帖這么說的：Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細胞外基質(zhì)，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在sigma叫ECM。zhangyong1036戰(zhàn)友提供的價格：BD公司

14、的matrigel 1500左右。如果購買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么Matrigel就不需要購買了。 下層培養(yǎng)液：下層常用含5%10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是最合適的。 細胞培養(yǎng)板：常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求，普通的細胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細胞培養(yǎng)板應(yīng)當與購買的Transwell小室相配套。 此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，

15、FN，Sigma有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。很多戰(zhàn)友認為這不是必須的，而且我也是不涂的，細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。linanping1979戰(zhàn)友認為，如果培養(yǎng)時間很長（>24h），細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。2步驟2.1 Transwell小室制備2.1.1 無基質(zhì)膠Transwell小室制備 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4風

16、干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37，30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝膠。2.1.2 有基質(zhì)膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM55

17、0系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300µl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1530min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。2.2 制備細胞懸液 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓1224h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至110×105，個人認為不要超過5×105。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測

18、的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有一定量的細胞存在。個人認為，對照組和處理盡量不要分開計數(shù)，因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結(jié)果。如果需要對細胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)一定要多重復幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。2.3 接種細胞 取細胞懸液100200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200µl。 24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這

19、里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內(nèi)對細胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必須限定在

20、24h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內(nèi)會有一定量的MMPs儲存，短時間內(nèi)可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發(fā)揮作用，影響MMPs表達，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應(yīng)，但前提是這個時間范圍內(nèi)細胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看

21、到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后12h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2.4 結(jié)果統(tǒng)計檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：2.4.1 直接計數(shù)法2.4.1.1 “貼壁”細胞計數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去。如下圖： 通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺肦藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊

22、紅染色等。個人推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細胞，直接染色即可。(2). 配制簡單方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm 測其OD值，間接反映細胞數(shù)。個人認為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因為，雖然經(jīng)過準確的細胞計數(shù)，往往穿過膜的細胞數(shù)仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標儀檢測。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。 細胞計數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Tr

23、answell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)。論壇里一般采用35個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數(shù)視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。 如圖，藍色部分表示膜的大小，白色圓形表示視野的大小，綠色方形則表示拍照時所

24、能拍下的視野的中心部分。這樣，每個小室都拍攝如下圖的16個視野進行計數(shù)，這樣得到結(jié)果是比較客觀和準確的。 2.4.1.2 “非貼壁”細胞計數(shù)由于某些細胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。如下圖： 2.4.2 間接計數(shù)法間接計數(shù)法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。2.4.2.1 MTT法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37 4h后取出。 24孔板中加入500µl DMSO，

25、將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測OD值。2.4.2.2 熒光試劑檢測這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。2.4.2.3 結(jié)晶紫檢測上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個優(yōu)點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。這是用正置顯微鏡拍攝的圖，結(jié)晶紫染色，進行細胞計數(shù)。 第三節(jié) Transwell的其他應(yīng)用的實驗步驟1Transwell腫瘤細胞遷移實驗過

26、程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認為，由于沒有基質(zhì)膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×105，而遷移實驗的密度是1×106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當下調(diào)，我做侵襲實驗的濃度是5%，遷移實驗的濃度是2.5%。2cathywxy戰(zhàn)友的Transwell上皮細胞培養(yǎng)步驟做了一段時間的原代細胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗?zāi)贸鰜砀蠹曳窒硪幌掳桑堄嘘P(guān)戰(zhàn)友共同探討：(1) 將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4含0.1胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無Ca 2、Mg2，無血清的MEM。(2) 用無菌的細胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細胞。(3) 離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium (Biofluids)沖洗一次。(4) 沖洗過后，將得到的細胞懸液用臺盼蘭測定活力，若存活率大于90，則將細胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5CO2-95% 空氣含5% 胎牛血