分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一、菌株復(fù)壯與單菌落菌株的獲取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基及抗生素抗性篩選培養(yǎng)基的配制，掌握高壓滅菌和獲取細(xì)菌單菌落菌株兩種基本實(shí)驗(yàn)操作技能。二、實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑1、實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（E. coli） DH5菌株：R-，M-，Amp-2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，無(wú)菌工作臺(tái)，高壓滅菌鍋3、試劑酵母浸膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，卡那霉素三、實(shí)驗(yàn)步驟液體LB（Luria-Bertain）培養(yǎng)基配方：蛋白胨(typtone)1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）氯化鈉 1.0% （1 g/100 m

2、l）PH 7.0固體LB培養(yǎng)基：每100 ml液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉請(qǐng)按試劑瓶上的編號(hào)使用相應(yīng)編號(hào)的藥勺取藥，防止藥品相互污染！(1) 每組按上述液體LB培養(yǎng)基配方，以配制100ml的量稱取藥品放入燒杯。(2) 用量筒量取約80 ml 蒸餾水注入燒杯中，玻棒攪拌使藥品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。(3) pH試紙檢測(cè)pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0。(4) 將100ml溶液分裝入兩個(gè)三角瓶，每瓶為50ml。(5) 按固體培養(yǎng)基配方稱取適量瓊脂粉分別放入兩個(gè)三角瓶中，以配制成兩瓶50ml固體LB培養(yǎng)基。(6) 兩個(gè)三角瓶分別用錫紙包扎瓶口。并用

3、記號(hào)筆在三角瓶上標(biāo)注各組標(biāo)記。(7) 把裝有培養(yǎng)基三角瓶放入滅菌鍋中，蓋上鍋蓋，以對(duì)稱方式擰緊鍋蓋，打開排氣閥通電加熱，至有連續(xù)的白色水蒸氣從排氣閥排出時(shí)，關(guān)閉排氣閥。當(dāng)高壓鍋溫度（氣壓）指示器指示鍋內(nèi)溫度升高至121（0.1Mpa）時(shí)，調(diào)節(jié)電壓（或利用手動(dòng)開關(guān)電源的方式）使高壓鍋穩(wěn)定在該溫度（壓力）下20 min，然后斷開電源。待指示器指示壓力降為0時(shí)，方可打開排氣閥，然后再打開鍋蓋小心取出鍋內(nèi)物品。(8) 取出三角瓶后，在酒精燈火焰旁進(jìn)行下述操作。(9) 取其中的一瓶直接倒培養(yǎng)皿，每皿倒入的量以剛好能在培養(yǎng)皿底鋪展成薄薄的一層即可。每組倒1塊培養(yǎng)皿，在皿蓋上用記號(hào)筆寫上“LB”及各組的標(biāo)記

4、。(10) 另外一瓶培養(yǎng)基待溫度降低至60左右時(shí)（剛能感覺不燙手），向培養(yǎng)基中加入0.1ml 50mg/ml的氨芐青霉素（Amp）溶液，使培養(yǎng)基中Amp的終濃度為50mg/L?？焖俪浞只靹蚝竺拷M倒1塊培養(yǎng)皿，在皿蓋上標(biāo)注“LB+”及各組的標(biāo)記。(11) 接種環(huán)蘸取菌液，密密劃線。(12) 倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(13) 一天后觀察菌落。四、思考題(1) 在說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用的菌種時(shí)用到這樣的符號(hào)：“R-，M-，Amp-”，這告訴我們關(guān)于該菌種的什么信息？(2) 在步驟7中，為何須待連續(xù)的白色水蒸氣從排氣閥排出時(shí)才能關(guān)閉排氣閥？當(dāng)滅菌完畢，為何又須待高壓鍋指示器指示壓力降為0時(shí)才能打開高壓

5、鍋，而且操作次序必須是先打開排氣閥然后才能打開高壓鍋蓋？(3) 在步驟12中，為何需將涂有菌的培養(yǎng)皿倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌的培養(yǎng)？為什么不是正放呢？(4) 你預(yù)計(jì)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是什么，即兩種培養(yǎng)基上菌的生長(zhǎng)情況如何？實(shí)驗(yàn)二 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馍倭抠|(zhì)粒制備方法與原理，掌握堿法小量提取質(zhì)粒DNA的操作步驟。二 實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)利用NaOH破壞菌體細(xì)胞使核酸物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)，因此稱為堿裂解法抽提。十二烷基磺酸鈉(SDS)能裂解細(xì)菌細(xì)胞膜，但更重要的作用在于其與鉀離子反應(yīng)后所引起的溶液中絕大部分蛋白質(zhì)以及基因組DNA共沉淀。由于還有很多蛋白質(zhì)不能被共沉淀掉，因此要進(jìn)一步用酚

6、、氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提。最后加入2倍體積的無(wú)水乙醇或0.7倍體積的異丙醇沉淀就能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法主要包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。三 實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pUC19后經(jīng)氨芐抗性篩選獲得的E. coli DH5系列菌株四 實(shí)驗(yàn)設(shè)備微量取液器(100l,1000l)， 臺(tái)式高速離心機(jī)五 試劑溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4冰箱。溶液：0.2 mol/L NaOH

7、、1 SDS (臨用前用0.4mol/L NaOH和2 SDS母液稀釋)。溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L飽和酚、氯仿、TE緩沖液六 實(shí)驗(yàn)步驟1. 用移液槍取1.5ml培養(yǎng)液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌體；2. 棄上清,將管倒置于吸水紙上盡量使液體流盡；3.菌體沉淀重懸浮于200l溶液中；4. 按試劑配方配制溶液，加入新配制的溶液200l, 蓋緊管口，快速溫和上下顛倒eppendorf管數(shù)次以混勻溶液(千萬(wàn)不

8、要振蕩，動(dòng)作輕柔)；5. 立即加入200l預(yù)冷的溶液，蓋緊管口并溫和顛倒離心管數(shù)次，混勻溶液，置冰浴中10分鐘；6. 12000 rpm離心10分鐘；7. 加入等體積的酚/氯仿(1:1)，顛倒混勻， 12000 rpm 10分鐘；8. 小心吸取上清夜移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘；9. 12000 rpm離心10分鐘；10. 棄上清, 將管倒置于吸水紙上使所有液體流出，加入200l預(yù)冷的70乙醇洗滌沉淀。11. 同步驟10，重復(fù)洗滌沉淀一次；12. 棄去乙醇溶液，將管倒置于吸水紙上使液體流盡，室溫或37下干燥； 13、將沉淀溶于5l

9、TE緩沖液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20冰箱中。注意 1. 提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫。 2. 提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好。最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除殘留的酚對(duì)質(zhì)粒的后繼實(shí)驗(yàn)，如酶切反應(yīng)等的不良影響。3. 沉淀DNA通常使用冰冷的無(wú)水乙醇,在低溫條件下放置時(shí)間稍長(zhǎng)可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇，但由于常把鹽沉淀下來(lái)，所以多數(shù)還是用乙醇。4. 質(zhì)粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復(fù)性。5用堿法分離質(zhì)粒DNA時(shí)，染色體DNA之所以可以被除去，是因?yàn)椋篊A.染色體DNA斷成了

10、碎片B.染色體DNA分子量大，而不能釋放C.染色體變性后來(lái)不及復(fù)性D.染色體未同蛋白質(zhì)分開而沉淀七 思考題1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？答：葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。2. 溶液II為何必需即用即配？答：NaOH溶液長(zhǎng)時(shí)間配制存放會(huì)與空氣中的CO2反應(yīng)，降低PH值，影響對(duì)細(xì)胞的裂解作用。3. 加入溶液II后作用時(shí)間不能長(zhǎng)，需要快速

11、加入溶液III中和堿性溶液。如果溶液II的作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者反應(yīng)過(guò)于激烈會(huì)導(dǎo)致什么后果？答：作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使細(xì)菌的基因組DNA被打斷，從而不能被徹底沉淀除去，影響質(zhì)粒DNA的純度。4. 在變性蛋白質(zhì)的過(guò)程中，為何必須注意不要將酚殘留在上清液中？答：殘留的酚對(duì)核酸酶具有抑制作用，因而會(huì)影響后面質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)。5. 最后DNA沉淀可以溶解在雙蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE緩沖液中，為何？答：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA

12、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)，了解質(zhì)粒DNA電泳條帶的多態(tài)性二、實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下, DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng).具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣,可進(jìn)行分離.凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA, 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)

13、而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱 ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快，開環(huán)與線狀分子的泳動(dòng)亦有差異，于是在電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生三個(gè)條帶的現(xiàn)象。三、試劑與儀器設(shè)備：1. 質(zhì)粒DNA2. 瓊脂糖3. 6×載樣buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚藍(lán)，30% 甘油450×TAE 電泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 m

14、ol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。5溴化乙錠(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5l貯存液，即凝膠中EB終濃度為0.5g/ml，此試劑為強(qiáng)致癌物，要戴手套操作，避免污染環(huán)境。6. DNA Marker：共6條帶，2000bp、 1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上樣6ul時(shí)750bp的帶約為100ng，其余帶約為50ng7各種國(guó)產(chǎn)移液器(10，20，100l)8消毒的tips槍頭9水平電泳槽和電泳儀四、實(shí)驗(yàn)步驟1、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于錐形瓶中,加入50ml 1×TAE稀釋緩沖液,放電爐上加熱至瓊

15、脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。 2、膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用擋板隔出需要制膠的空間，將膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封擋板內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入1×TAE緩沖液至液面恰好沒過(guò)膠板上表面。

16、因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。 4、加樣：取1l DNA溶液與適量載樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。質(zhì)粒DNA加樣完畢，選取一個(gè)未加樣點(diǎn)樣孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一個(gè)樣品要更換tip槍頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約21cm時(shí),停止電泳。 6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。 7、觀察：在波長(zhǎng)

17、為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。注意 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析質(zhì)粒DNA電泳條帶的形態(tài)。根據(jù)DNA marker分析質(zhì)粒DNA溶液大致的濃度。六、思考題1、電泳時(shí)所加電壓值如何確定?答：可根據(jù)DNA大小來(lái)確定，越大的電壓可低點(diǎn)，避免拖尾現(xiàn)象；越小的電壓可適當(dāng)大一點(diǎn)縮短電泳時(shí)間，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)DNA擴(kuò)散導(dǎo)致條帶模糊。2、就你的理解，DNA mark

18、er的用途是什么?答：分析DNA大小和濃度的依據(jù)。3、電泳中用到兩種buffer，各自的作用。答：上樣緩沖液主要作用： （1）螯合Mg 2，防止電泳過(guò)程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mmol/l的EDTA。 （2）增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。而在大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。 （3）指示劑監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過(guò)程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。電泳緩沖液的作用：一是維持合適的pH；二是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于D

19、NA分子的遷移。 此外，電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。 4、如果質(zhì)粒DNA電泳條帶只有一條，說(shuō)明提取的質(zhì)粒質(zhì)量高還是低，為什么？答：質(zhì)量高。這說(shuō)明產(chǎn)生只有超螺旋的正常質(zhì)粒閉合環(huán)雙鏈DNA。實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法二、 實(shí)驗(yàn)原理1、 感受態(tài)細(xì)胞的概念 重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。 在原

20、核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬(wàn)倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油或-70保存（有效期6個(gè)月）。2、 轉(zhuǎn)化的概念及原理 在基因克隆技

21、術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法，如電擊法、CaCl2等化學(xué)試劑法處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理過(guò)的細(xì)菌，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌可以在加入抗生素的培養(yǎng)基上形成菌落。三、 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 前次實(shí)驗(yàn)中所復(fù)壯的大腸桿菌單菌落液體培養(yǎng)物2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器具 低速冷凍離心機(jī)、超凈工作

22、臺(tái)、50 ml 離心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三種器具均已經(jīng)過(guò)滅菌處理）。3、試劑及配置0.1 M氯化鈣溶液（配制：稱取1.1g無(wú)水氯化鈣，溶于90ml雙蒸水中，定容至100 ml, 轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，121 滅菌20 min，保存。四、 實(shí)驗(yàn)步驟教師完成：1.挑取實(shí)驗(yàn)一中平皿培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好、外觀呈圓形的單菌落，接種于實(shí)驗(yàn)一配好的LB液體培養(yǎng)基（試管裝）中，37 200rpm振蕩培養(yǎng)14 h 。2.按1：50-1：100的比例進(jìn)行接種，例取1.5 ml 上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在25 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 200rpm振蕩培養(yǎng)2-3 h （菌液的OD600約為0.40.5）。學(xué)生操作：3

23、.每小組（按實(shí)驗(yàn)一確定的4人組）領(lǐng)取一支離心管（已滅菌，不要隨便打開），貼上自己的標(biāo)簽（鉛筆寫學(xué)號(hào)），按老師安排兩個(gè)小組同步在超凈工作臺(tái)上工作，每個(gè)小組用10 ml的移液管（已滅菌）吸取10 ml菌液放入自己的離心管中，兩個(gè)小組將離心管與蓋子一起置天平上進(jìn)行平衡，平衡后蓋上蓋子置于盛有冰塊的盆中冰浴10分鐘（時(shí)間可超過(guò)十分鐘）。待滿8管后送至離心機(jī)所在的實(shí)驗(yàn)室中，4000 rpm ，4 ,離心10 min 。4.兩小組同步在超凈工作臺(tái)上傾去上清液，用5 ml的移液管（已滅菌）量取5 ml預(yù)冷的氯化鈣溶液加入離心管中，用手輕彈管壁將沉淀混勻,兩小組間用氯化鈣平衡，冰浴25 min（可延長(zhǎng)） ,待

24、有8管后4000rpm，4 ,離心10 min。5.在超凈工作臺(tái)上傾去上清液，用取液槍吸取1ml冰浴預(yù)冷的氯化鈣溶液加入離心管中，輕彈管壁使細(xì)菌懸浮，制成感受態(tài)的細(xì)胞懸浮液，用取液槍轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml eppendolf管中，按順序擺放在離心管盒中，置70 保存。注意：實(shí)驗(yàn)從第三步開始，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都必須無(wú)菌操作！五、思考題1、用試劑瓶盛裝的氯化鈣在滅菌時(shí)應(yīng)怎樣操作？答：可以高溫高壓滅菌，也可以過(guò)濾滅菌。高溫高壓滅菌注意蓋子不要蓋得太緊。2、步驟3和4中，對(duì)離心機(jī)應(yīng)當(dāng)做什么樣的預(yù)處理？答：由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在低溫下進(jìn)行，因此需要對(duì)離心機(jī)進(jìn)行4 的預(yù)冷。3、實(shí)驗(yàn)為什么必須全程在無(wú)菌條件下操作？

25、答：防止雜菌和雜DNA的污染。否則會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義，學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后，通過(guò)熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒能夠自主復(fù)制并在宿主中實(shí)現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用的pUC19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp )，理論上只有轉(zhuǎn)入了pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽(yáng)性），

26、因此尚需提取質(zhì)粒酶切、電泳作進(jìn)一步的鑒定。三、試劑與儀器設(shè)備：1LB培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）氯化鈉 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固體培養(yǎng)基：100 ml液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉含氨芐青霉素（Amp）50mg/l的固體LB培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基中加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手時(shí)加入Amp鋪培養(yǎng)皿。20.1mol/L CaCl2 高壓滅菌消毒或過(guò)濾除菌。3pUC19質(zhì)粒 配制成約50ng/l。4感受態(tài)DH5大腸桿菌 5恒

27、溫水浴箱6超凈工作臺(tái)7恒溫?fù)u床8生化培養(yǎng)箱9無(wú)菌離心管10無(wú)菌tips 11玻璃涂布器1275%乙醇13標(biāo)記筆四、實(shí)驗(yàn)步驟教師操作：1、從-70冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上學(xué)生操作（四人一組）：2、每組從冰上取2管感受態(tài)細(xì)胞懸液（每管200l），其中一管加入50ng/l的pUC19質(zhì)粒DNA溶液1ul，貼上各自組的標(biāo)簽，另一個(gè)加入1 ul無(wú)菌水后，也貼上標(biāo)簽，兩個(gè)離心管同時(shí)在冰上放置30分鐘。3、將兩個(gè)離心管同時(shí)轉(zhuǎn)入42水浴中熱激90秒后，迅速置于冰上1-2分鐘。在超凈工作臺(tái)上分別向兩管中加入800 ul LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，37恒溫?fù)u床緩慢振蕩培養(yǎng)45

28、分鐘。 4、以5000rpm離心濃縮菌液，在超凈工作臺(tái)上分別取上述兩個(gè)離心管中的菌液100l ，各自涂布于一個(gè)含Amp的篩選平板上，用標(biāo)記筆分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)化組、對(duì)照組，待菌液干后，倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)（第二天下午3：00后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)本應(yīng)設(shè)置兩個(gè)對(duì)照： 對(duì)照組1 用來(lái)判斷不加入質(zhì)粒的大腸桿菌在抗性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的狀況，排除假陽(yáng)性對(duì)照組2 用來(lái)判斷制備成感受態(tài)后的大腸桿菌在普通培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況五、計(jì)算轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)（CFU）可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)×涂板前離心管中菌

29、液體積涂板時(shí)所用菌液體積轉(zhuǎn)化頻率 轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA加入量(mg) 轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細(xì)胞總數(shù) 六、思考題1、“E. coli DH5菌株： R，M，Amp”提供了哪些關(guān)于該菌株的信息？2、步驟3中，為何在大腸桿菌轉(zhuǎn)化完成后需要在不含Amp的LB培養(yǎng)基中緩慢振蕩培養(yǎng)45 min后方能涂布于抗性篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選？ 3、設(shè)對(duì)照1、2分別有什么目的？在上述實(shí)驗(yàn)中，我們實(shí)際做了哪個(gè)對(duì)照？實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA的限制性酶切、PCR擴(kuò)增與檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握PCR、限制性內(nèi)切酶酶切的技術(shù)原理和操作要點(diǎn)，增進(jìn)對(duì)理論知識(shí)的理解。二、實(shí)驗(yàn)原理1、限制性內(nèi)切酶酶切 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱

30、為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)

31、稱軸處切割產(chǎn)生平末端的DNA片段，有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩

32、沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加1單位酶,消化1-2小時(shí)。2、PCR PCR即聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是近年發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異性DNA 的技術(shù)。PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA、引物和種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA 結(jié)合的特異性。反應(yīng)分3步：變性：通過(guò)加熱使DNA 雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜

33、交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。延伸：在DNA聚合酶和4 種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，5'3'的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)，以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，數(shù)小時(shí)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×1067拷貝。3、瓊脂糖凝膠電泳 參見實(shí)驗(yàn)三。三、實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑1. 上下游引物: 濃度為各10 pmol/l。 5' AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3', 5' AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTC

34、TTGACTGG 3'， 2DNA模板：大豆基因組，濃度為100ng/l。410×buffer（購(gòu)買Taq酶配套buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 1005MgCl2：25mmol/L。6dNTP 2.5mmol/L：分別取等體積的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四種混合即成7Taq DNA聚合酶：濃度為2.5 U/l。8滅菌雙蒸水9. 10X buffer（購(gòu)買限制性內(nèi)切酶配套buffer）10. SalI限制性內(nèi)切酶：10U/ul11. 質(zhì)粒DNA：200ng/5ul12

35、. 6×載樣buffer：0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚藍(lán)，30% 甘油1350×TAE 電泳Buffer： 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。14溴化乙錠(EB)溶液：10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5l貯存液，即凝膠中EB終濃度為0.5g/ml，此試劑為強(qiáng)致癌物，要戴手套操作，避免污染環(huán)境。15. DNA Marker 16各種國(guó)產(chǎn)移液器(10，20，100l)17消毒的0.2ml、.ml PCR管，10l，100l tips18恒溫水浴鍋19PCR儀20水

36、平電泳槽和電泳儀四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）PCR：各種試劑置冰盒中，取已滅菌的0.2ml PCR管，于冰上按下表操作（注：根據(jù)質(zhì)粒濃度來(lái)決定質(zhì)粒模板的加入量）：反應(yīng)體系配制（10l體系）試劑加入量終濃度(或含量)DNA模板1l100ng10×buffer2l1×bufferdNTP1l2.5mmolMgCl20.5l約2.5mM/L上下游引物1l（各10 pmol/l）各10pmolTaq DNA聚合酶0.5l (2.5 U/l)1.25U無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足20l總體積10l 用槍混勻反應(yīng)液，稍離心，蓋緊蓋子，編號(hào)。于PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)置為：94 預(yù)變性 5min

37、 以下35次循環(huán) 94 變性 55S 55 退火 45s 72 延伸 55s 最后 72 7min（二）限制性內(nèi)切酶酶切：試劑加入量終濃度(或含量)質(zhì)粒DNAxl500ng1ug10×buffer1l1×bufferSal I0.1l(10 U/l)1U無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足10l總體積10l 注：加入質(zhì)粒DNA溶液的體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)五電泳結(jié)果決定，取的體積保證加入的質(zhì)粒為500 ng1ug即可。加蓋，混勻后稍離心，37水浴反應(yīng)3h。反應(yīng)完畢，于80水浴20min使酶失活。 （三）瓊脂糖凝膠電泳 步驟略，請(qǐng)自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟。五.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析PCR結(jié)果如何？限

38、制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果如何？預(yù)期應(yīng)是怎樣的電泳結(jié)果？如果電泳結(jié)果與預(yù)期不符，請(qǐng)分析原因。實(shí)驗(yàn)七 細(xì)菌染色體DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)菌染色體DNA的制備方法與原理，掌握其操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理從細(xì)菌中分離染色體DNA包括幾個(gè)基本步驟：收集細(xì)胞；由溶菌酶水解肽聚糖的糖苷鍵從而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁；蛋白酶K降解蛋白質(zhì)成為小分子肽段；酚、氯仿變性、抽提溶液中的蛋白質(zhì)；無(wú)水乙醇或異丙醇沉淀DNA就能得到質(zhì)量穩(wěn)定的染色體DNA。三、實(shí)驗(yàn)材料普通細(xì)菌四、實(shí)驗(yàn)設(shè)備微量取液器(100l,1000l)， 臺(tái)式高速離心機(jī)，制冰機(jī)五、試劑溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)

39、， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4冰箱。3 mol/L NaAc（pH5.2）、 Tris飽和酚/氯仿（1:1）、TE緩沖液、RNase六、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取菌液1mL，12000rpm離心1min，棄上清。2. 加入100 µL溶液I，在漩渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散。3. 再加入650 µL 溶液I，振蕩混勻。4. 向懸液中加入7.5 µL的100mg/mL溶菌酶至終濃度為1mg/mL，混勻，37溫浴30分鐘。5. 向懸液中加入7.5 µL蛋白酶K（10mg/mL），混勻，5

40、5繼續(xù)溫浴1-1.5 h，中間輕緩顛倒離心管數(shù)次。6. 溫浴結(jié)束后向溶液中加入用等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液(750 µL)抽提，12000rpm離心5min；取上清再用等體積的氯仿/異戊醇溶液抽提一次，12000rpm離心5min。7. 取上清（約500 µL ）至新的離心管中，向上清中加入1/10體積（約50 µL ）的3 mol/L醋酸鈉（pH5.2）混勻，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，-20靜止30分鐘沉淀DNA，取出， 4 12000rpm離心10min，棄上清（注意別將沉淀倒掉）。8. 用1mL 70%酒精洗滌，棄上清，沉淀放入37烘箱中數(shù)分鐘除去酒

41、精。9. 用40 µL TE溶解，加入2uL RNaseA，37溫浴20min，-20 保存。實(shí)驗(yàn)八 植物基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?學(xué)習(xí)植物DNA分離的原理，掌握植物基因組DNA提取的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理由于植物細(xì)胞有細(xì)胞壁及其細(xì)胞內(nèi)高含量的多糖類物質(zhì)，因此用于真核細(xì)胞基因組DNA提取的一般方法用在植物細(xì)胞上并不十分有效。常用的方法有CTAB法和SDS法。這里我們采用CTAB法進(jìn)行植物基因組DNA的提取。CTAB法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的簡(jiǎn)便方法。本方法通過(guò)液氮研磨粉碎植物組織、裂解液（CTAB溶液）裂解細(xì)胞、有機(jī)溶劑抽提，使進(jìn)入水相的核酸與蛋

42、白成分分開，在RNA酶作用下，降解RNA，得純度較高的DNA樣品。CTAB是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白、多糖類物質(zhì)分開。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。三、試劑與儀器設(shè)備：1、CTAB Buffer (裂解Buffer) CTAB 2（w/v） Tris-HCl（pH 8.0） 100 mM EDTA（pH 8.0） 20 mM NaCl 1.4 M2、氯仿/異戊醇（24:1）3、3M NaAc4、RNaseA 10mg/ml 5、異丙醇 6、-巰基乙醇 7、氯仿/異戊醇（25/24/1） 8、70%乙醇 9、恒溫水浴鍋 ，臺(tái)