類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Fas表達(dá)的研究(一)

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Fas表達(dá)的研究(一)    摘 要 目的：研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)患者滑膜組織中細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因蛋白Fas的表達(dá)和意義。方法：采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)9例患者及8例正常對(duì)照滑膜組織中凋亡細(xì)胞及Fas的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：RA患者滑膜組織中細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，而Fas陽(yáng)性的細(xì)胞百分比卻明顯高于對(duì)照組。結(jié)論：RA患者滑膜組織中細(xì)胞凋亡的減少可能是導(dǎo)致滑膜過(guò)度增生進(jìn)而關(guān)節(jié)功能喪失的原因之一，F(xiàn)as表達(dá)雖增多但不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)

2、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性疾病，我國(guó)成人中發(fā)病率約為0.3%。RA的主要病理特征是關(guān)節(jié)滑膜的增生和軟骨及骨組織的侵襲破壞，有很高的致殘率，其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。近年的研究表明，細(xì)胞凋亡是其發(fā)病中的一個(gè)重要機(jī)制13。我們采用TUNEL法和免疫組化法對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的RA患者及對(duì)照的滑膜組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Fas表達(dá)的研究，旨在探討RA滑膜增生的機(jī)制及凋亡相關(guān)基因Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在RA發(fā)病中的作用。1 資料與方法1.1 臨床資料 在西安市第五醫(yī)院住院手術(shù)治療RA患者9例，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性2例，

3、女性7例，年齡16歲67歲，平均年齡(32.8±15.0)歲，病程1 a23 a，平均病程(12.8±7.7) a。所有患者均有不同程度的關(guān)節(jié)活動(dòng)性病變(有3個(gè)或3個(gè)以上關(guān)節(jié)持續(xù)性腫脹)，平均受累關(guān)節(jié)數(shù)為18個(gè),6例類風(fēng)濕因子(RF)陽(yáng)性,3例陰性,血沉16 mm/h83 mm/h，平均(55.0±23.6) mm/h，其中關(guān)節(jié)功能分級(jí)：級(jí)2例，級(jí)1例，級(jí)5例，級(jí)1例。關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)分期：期2例，期1例，期6例?；颊呋そM織均取自滑膜切除術(shù)中的膝關(guān)節(jié)和/或腕關(guān)節(jié)，8例正常對(duì)照的滑膜組織取自骨折或外傷截肢者的膝關(guān)節(jié)。1.2 組織處理 切取0.5 cm1 cm滑膜組織,

4、4%多聚甲醛固定,3%EDTA脫鈣,石蠟包埋，用10%的多聚賴氨酸處理載玻片,滑膜組織切片為6 m,室溫貯藏備用。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧核糖核酸缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，3%H2O2處理樣品切片10 min后,用蛋白酶K(ProteinaseK)于37 消化5 min;取TdT和DIGdUTP各1 l,加入18 l標(biāo)記緩沖液于滑膜組織片37 雜交2 h;封閉液孵育30 min,生物素化抗地高辛抗體反應(yīng)30 min;SABC稀釋液反應(yīng)30 min,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染。陽(yáng)性對(duì)照采用乳腺癌石臘切片,陰性對(duì)照采用PBS替代第一抗體。1.3.2

5、Fas單克隆抗體免疫組化 滑膜切片二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,0.3%H2O2的甲醇液沖洗,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入1%牛血清白蛋白,20 孵育15 min。第一抗體用鼠抗人Fas多克隆抗體在4 下孵育16 h，第二抗體(堿性磷酸酶生物素標(biāo)記的抗鼠IgG)孵育20 min，用3hydroxy2naphthylocid2,4dimethylaniline進(jìn)行呈色反應(yīng)。細(xì)胞核用蘇木素染色。1.3.3 結(jié)果判定 TUNEL法染色胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。Fas標(biāo)記陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)，陽(yáng)性結(jié)果為紅色顆粒，并在光學(xué)顯微鏡10×10倍視野下,在每個(gè)樣本關(guān)節(jié)滑膜組織中隨機(jī)選

6、取2個(gè)4個(gè)視野,分別計(jì)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)平均凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和Fas陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s進(jìn)行RA組與對(duì)照組間t檢驗(yàn)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)取雙側(cè)=0.05。2 結(jié)果2.1 TUNEL法細(xì)胞凋亡在滑膜組織中的表達(dá) RA組與對(duì)照組均可見(jiàn)細(xì)胞凋亡,但RA患者滑膜襯里層中細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，兩組相比差異具有顯著性(P0.05)。2.2 Fas蛋白在RA患者滑膜組織中的表達(dá) RA組與正常對(duì)照組均可見(jiàn)Fas的陽(yáng)性表達(dá),但RA患者滑膜襯里層中Fas陽(yáng)性的細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組，兩組相比差異具有顯著性(P0.05)，見(jiàn)表1。表1 凋亡細(xì)

7、胞及Fas在滑膜襯里層細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)計(jì)數(shù)結(jié)果（略）注:與對(duì)照組比較*P0.053 討論RA的病理特征主要表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)的增殖與炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致滑膜增厚、骨與軟骨組織的受損，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。目前對(duì)滑膜增生的確切原因還不清楚，但這些細(xì)胞的積累肯定部分與細(xì)胞凋亡抵抗或缺陷有關(guān)1。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜細(xì)胞明顯增生，而細(xì)胞凋亡率卻明顯減少，說(shuō)明RA患者滑膜細(xì)胞不因過(guò)度增生而出現(xiàn)過(guò)多的細(xì)胞凋亡，符合其病理特點(diǎn)，提示滑膜細(xì)胞的凋亡障礙可能是導(dǎo)致滑膜增厚的原因之一。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控,有些基因如Fas、Bax、腫瘤壞死因子等誘導(dǎo)凋亡，而B(niǎo)cl2、P53等抑制凋亡的發(fā)生4。

8、Fas蛋白是一種細(xì)胞膜表面受體，是型膜蛋白，屬于TNF家族，F(xiàn)asL是TNF家族的細(xì)胞表面分子，屬于型膜蛋白，F(xiàn)as與FasL的結(jié)合可導(dǎo)致攜帶Fas的細(xì)胞凋亡5。已證實(shí)Fas作為凋亡主要誘導(dǎo)因子，存在于滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及滑膜浸潤(rùn)單個(gè)核細(xì)胞，另有報(bào)道，F(xiàn)as蛋白可在RA和OA患者滑膜細(xì)胞表達(dá)，與抗Fas抗體結(jié)合后可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，表明滑膜細(xì)胞表面的Fas具有傳導(dǎo)凋亡信號(hào)的功能6，RA的關(guān)節(jié)破壞可能與Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)2。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as在RA患者的滑膜細(xì)胞的高表達(dá)率，與細(xì)胞凋亡減少并不一致，結(jié)合既往研究報(bào)道滑膜襯里層細(xì)胞本身不能同時(shí)表達(dá)Fas和FasL而誘導(dǎo)自身細(xì)胞的凋亡5，從而我

9、們推測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡的下降可能是因?yàn)镕asL的減少，使Fas不能與FasL結(jié)合將信號(hào)傳遞給細(xì)胞，進(jìn)而抑制和阻斷了Fas介導(dǎo)的凋亡途徑。另有研究報(bào)道，只有少量單個(gè)核細(xì)胞上Fas與FasL同時(shí)表達(dá)(5%)，滑膜表層發(fā)生凋亡的細(xì)胞大多數(shù)同時(shí)表達(dá)Fas和FasL，且Fas陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞與FasL陽(yáng)性的單個(gè)核細(xì)胞位置上毗鄰7，這一點(diǎn)也解釋了RA滑膜細(xì)胞雖高表達(dá)Fas但仍能夠存活及增殖。綜上所述，本研究結(jié)果表明，RA滑膜細(xì)胞凋亡減少，凋亡相關(guān)基因Fas表達(dá)增高，細(xì)胞凋亡并不隨滑膜的增生而增加，其凋亡誘導(dǎo)因子Fas表達(dá)雖增加，但可能因其配體FasL減少而不能誘導(dǎo)凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞增生與凋亡的不平衡，最終引起

10、RA滑膜的增生及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，但因多種基因同時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的減少可能僅是RA滑膜增生的原因之一。參考文獻(xiàn)：1 劉莉莉.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡分子的研究進(jìn)展J.上海免疫學(xué)雜志，2003：142144.2 陸意.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展J.國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2001：256259.3 劉繼紅，李衛(wèi)東，林志彬.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡的研究現(xiàn)狀J.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2003，8(2)：232236.4 Chouct,yang JS,Lee MR,et al. Apoptosis in rheumatoid arthritisexpression of Fas,FasL,P53,and Bcl2 in rheumatoid synovial tissues J.Pathology,2001,193:110.5 張興民，蔣明，鄭德先，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜細(xì)胞增生與Fas和bcl2基因的表達(dá)J.中華醫(yī)學(xué)雜志，1998，78(3)，1751786 Nakajima T, Aono H, Hasunuma T,