腫瘤血管生成抑制劑篩選模型的研究進展

1、腫瘤血管生成抑制劑篩選模型的研究進展葛 慧，張洪泉（揚州大學醫(yī)藥研究所藥理研究室，揚州225001）摘要 目的：介紹腫瘤血管生成抑制劑（tumor angiogenesis inhibitor，TAl）篩選模型的研究進展。方法：查閱國內外相關文獻進行分析和歸納。結果：TAI的篩選主要依賴于采用形態(tài)學檢測法測定血管的生成活性。TAI篩選的程序為：體外篩選體內篩選應用腫瘤模型進行全面最終的評價。結論：TAI對于腫瘤治療有重要作用，其篩選模型的研究取得突破性進展。關鍵詞 血管生成抑制劑；藥物篩選試驗，抗腫瘤；綜述中圖分類號 R 965.1 文獻標識碼 A 文章編號 1671-2838（2005）04

2、-0381-04Advances in research on screening modelS OftUmot angiOgenesiS inhibitorsGE Hui，ZHANG Hong-Quan（Department OfPharmacology，Institute OfMedlclne and Pharmacy，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China）ABSTRACT Objective：TO review advances in research on tumor angiogenesis inhibitors（TAl） Methods

3、：The domestic and foreign relevant literature was sunnnarized and analysedResults：The methods fOr screening TAl were mainly deterlnining the angio-genesis activityThe morphology assay was adopted tO measure the angiogenesis activityThe procedures were screening in vitroscreening in vivousing tumormo

4、dels tO carry out overall and final appraisal.Conclusion：TAI has important effects On cancerthera-pyThe studies Ofscreening mOdels OfTAI have already got breakthroughKEYWORDS angiogenesis inhibltors；drugscreeningassay，antitunior；reviewPharm Care & Res，2005，5（4）：381-384腫瘤血管生成抑制劑（tumor angiogenesi

5、s inhibi-tor，TAl）能抑制血管生成，阻止腫瘤生長和轉移。TAT治療腫瘤具有副作用小、不易產生耐藥性等優(yōu)點。近年來這類藥物的研究已取得突破性進展，可望進入臨床成為一類嶄新的、有希望的抗腫瘤藥物。本文就目前常用的TAI篩選模型作一簡要介紹。1、腫瘤發(fā)展依賴血管生成的機制1971年Folkman在新英格蘭醫(yī)學雜志（N Engl J Med）上首次提出腫瘤生長依賴血管形成的概念：當腫瘤直徑超過2mm時，直接由微環(huán)境提供的營養(yǎng)就不能滿足其生長需要，此時腫瘤的生長依賴于新生血管運送營養(yǎng)物質。新血管的生成是一個多步驟的、受多因素調控的復雜過程，這一過程包括：促血管生成因子的分泌、血管內皮基底膜

6、的降解、內皮細胞的遷移與增殖、新的血管環(huán)與基底膜的形成。目前專家認為血管生成是正性和負性調節(jié)因子共同作用的結果，已發(fā)現的正負調節(jié)因子有60余種。正性調節(jié)因子有：堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、血管生成素等。它們可以直接刺激血管內皮細胞的生長，或通過促使宿主細胞釋放有關生長因子來刺激血管內皮細胞的增生。血管內皮細胞受刺激后基底膜降解，內皮細胞數增多，浸潤到血管周圍基質，降解細胞外間質并向血管生成因子產生的方向移動，在腫瘤組織內形成新的血管。負性調節(jié)因子包括天然的和合成的兩大類，宿主細胞產生的天然因子有：血管抑制素、內皮抑制

7、素、生長抑素等?；瘜W合成的有：基質金屬蛋白酶抑制劑、黏附分子的拮抗劑、煙曲霉素及其衍生物TNP-470等。它們的功能是抑制內皮細胞的增殖、游走、基底膜的降解以及基底膜與生長因子結合等。正常情況下正負因子的調節(jié)保持動態(tài)平衡關系，一旦失衡則導致新血管的生成，此即血管形成的開關平衡假說。2、腫瘤血管生成活性的檢測TAI的篩選主要依賴于血管生成活性的檢測。為了對大量TAI進行快速、高效、低成本、微量化的篩選，必須采用高靈敏的檢測系統(tǒng)和數據采集處理系統(tǒng)。在此簡單介紹幾種常用的檢測方法。2.1 形態(tài)學檢測法 將腫瘤組織移植到雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane）、倉

8、鼠頰窩、兔耳等部位，在顯微鏡下觀察腫瘤組織誘導血管生成的情況，計數微血管密度最高的區(qū)域即“熱點”區(qū)的血管數，也可用電鏡觀察腫瘤結節(jié)內及鄰近組織中的微血管結構和毛細血管超微結構。2.2 免疫學檢測 用凝血因子、CD31等來標記內皮細胞，通過檢測標記物濃度可檢測血管生成活性。新近采用一種近紅外（near infrare，NIR）熒光探針（Cv5.5）標記內皮細胞，選擇“熱點”區(qū)域，計數或采用計算機圖像分析系統(tǒng)，對血管生成進行定量分析，并能選擇性地定位腫瘤組織。2.3 影像學檢測 彩色多普勒超聲可全面反映腫瘤血流情況，包括血流速度、方向，是否為層流或湍流等特征，但此法對血管生成的定量分析效果較差。3

9、、血管生成抑制劑的篩選篩選的程序一般先經分子、細胞水平的體外篩選，再經組織、器官水平的體內篩選，最后應用腫瘤模型進行全面最終的評價。體外篩選操作較簡單，容易控制。體內篩選的優(yōu)點是實驗條件比較接近藥物在人體內使用的環(huán)境。3.1 體外篩選3.1.1 血管內皮細胞模型 血管內皮細胞是進行TAI篩選的主要的細胞模型，國際上現在采用較多。如人臍靜脈血管內皮細胞ECV304。該模型的主要檢測指標有：細胞增殖率（可通過2.1所述的形態(tài)學方法檢測）與藥物促進內皮細胞形成管腔的能力。血管生成過程中內皮細胞會形成細胞條索，然后形成管狀，體外培養(yǎng)的血管內皮細胞在特定條件下也可以形成細胞條索狀。在含有TAI藥物和不含

10、有TAI藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)內皮細胞4d后，在顯微鏡下比較它們形成的管腔數目，可用來評定TAI對新生血管的抑制作用。最近國外有學者將人類的端粒酶催化蛋白（hTERT）的基因導入內皮細胞，使其永生化，形成的新細胞株被命名為HMVEC，它不僅保留了原代內皮細胞（HMEC-1）的固有特征，且避免了用HMEC-1作為體外篩選模型時可能出現的原有血管的干擾現象，并且對VEGF的抑制作用特異性很高，有希望成為理想的體外模型。3.1.2 血管生成因子模型 血管生成因子的檢測研究較多的是VEGF和bFGF。選擇血管生成因子高表達的實體瘤細胞株體外培養(yǎng)，加入待檢物質作用?4h后，應用免疫酶標法、同位素標記法

11、等檢測血管生成因子含數。通過待檢物質是否影響腫瘤細血管生成。3.1.3 高通量篩選模型（high throughput screening，HTS）近年來腫瘤新生血管相關基因組的研究為TAI的篩選提供了新靶點，從而有條件進行針對特定基因型藥物的研發(fā)?；蛑亟M是近年來發(fā)展起來的一項新技術，可使用基因重組技術制備與腫瘤血管生成密切相關的受體，如VEGF受體、bFGF受體等，建立TAI的HTS模型。重組受體具有純度高、制備量大、成本低等優(yōu)點，因此使用基因重組進行藥物篩選具有廣闊的前景。3. 2 體內篩選 TAI的篩選，必須建立組織、器官水平的體內模型，經這些模型評價有效后，才能進入下一階段的研究。近

12、年來常采用的體內模型有：雞胚絨毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基質膠塞模型（matri-gel plug）、嚙齒動物的角膜微囊（microdocket corne-。）模型等。建立這些模型都是為了尋找無血管區(qū)域或原血管能明顯與新生血管相區(qū)別的區(qū)域進行TAI的篩選。3.2.1 雞胚絨毛尿囊膜模型 雞胚絨毛尿囊膜的血管生成早期，機體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，因此雞胚絨毛尿囊膜對各種異物幾乎不發(fā)生排斥反應，便于將含有TAI的載體置于其表面，觀察TAI對血管生成的影響。Bernardini等建立了一種雞胚絨毛尿囊膜血管生成的定量分析法：將雞胚胎放在直徑100mm無菌的玻璃平皿內，加入5mL培養(yǎng)液，在無菌恒溫箱中孵

13、育到第9天的生長高峰時，將浸泡過TAI的明膠海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面。由兩個實驗人員同時在250倍顯微鏡下隨機取6個視野，記數“熱點”區(qū)的新生血管數，計算平均值。3.2.2 鼠耳模型 李凌等利用綠色熒光蛋白（GFP）基因標記膀胱癌細胞BTT739株，把含有1×1031×104個標記后的癌細胞懸液接種于半透明的鼠耳皮下，借助熒光顯微鏡及血管造影觀察腫瘤生長所造成的局部血管改變和新血管的生成情況。通常于接種后立即觀察并攝像記錄腫瘤細胞的數量和分布，此后每天或隔天麻醉小鼠后用熒光顯微鏡觀察耳部血管改變，發(fā)現接種3-4d時腫瘤細胞附近的小血管和毛細血管管腔擴張和彎曲最為明顯，5-

14、10d后可見血管出芽及新生血管形成。連續(xù)血管造影可顯示血管生成的動態(tài)變化過程，此時注射TAT于鼠耳下，觀察其對血管新生的抑制作用。此模型操作簡便，且對動物損傷較小，并能反映TAI抑制腫瘤新血管生成的實際過程。3.2.3 基質膠塞模型 此模型被廣泛用于評價生長因子的促血管新生能力，如VEGF。基質膠在4的時候是液態(tài)，37時能夠形成固體凝膠。把0.5ml的基質膠與生長因子混合后注射到荷瘤小鼠腹部皮下組織，在小鼠體溫的條件下基質膠很快形成固體凝膠。4-5d后相鄰組織新生血管出芽，生長因子緩慢釋放滲入組織中；7-10d后處死小鼠，取出基質膠塞進行10%甲醛固定、石蠟包埋、切片染色、組織學檢查，圖像分析

15、塞內的總血管面積，可以對血管生成進行定量分析，以評價TAT療效。3.2.4 角膜微囊模型 此模型多采用嚙齒動物如兔、鼠的角膜，與TAT的其他體內模型相比，用角膜微囊時對動物的操作更簡便，由于角膜本身無血管，因此只要觀察到血管進入角膜即可認為是新血管生成，可以避免其他模型中原有血管干擾的影響。尤其是用兔角膜可直觀監(jiān)測腫瘤血管生成和炎性反應的過程。重組生長因子、細胞懸液或組織標本加入TAI后制成可緩慢釋放的小丸置入微囊，Bernardini等將體重為2-3kg的健康新西蘭白兔麻醉后，在離角膜邊緣2.5-3mm處用虹膜刀植入3mm×1.5mm×3mm微囊，3-4d后血管叢邊緣出芽

16、，7-10d內新生毛細血管進入微囊。通過計數囊內新生毛細血管數和生長率可評價TAT對血管新生的抑制作用。3.3 腫瘤模型 腫瘤模型是用來檢測藥物的抗血管生成和抗腫瘤作用的最終模型，前者以小鼠Lewis肺癌、黑素瘤B16為主，后者最常用的是裸小鼠異種移植模型：把腫瘤細胞接種到裸小鼠皮下，給藥期間測量腫瘤的三維直徑，同時還可測定腫瘤組織中的血管密度，電鏡觀察血管內皮細胞的狀態(tài)，檢測體液中血管生成因子及其受體的表達量來判定該物質抑制體內血管生成的能力。4、討 論抑制腫瘤血管生成已被公認為一種嶄新的抗癌手段。隨著TAI研究開發(fā)的深入，新的藥物將不斷涌現并逐步從實驗室走向臨床，為抑制腫瘤的增殖、預防腫瘤的轉移和復發(fā)，提高患者的生存質量起到重要的作用。目前，TAI的研究中仍有許多值得關注、亟待解決的問題，如：TAI作用的具體的分子機制還不十分清楚；TAI不僅抑制腫瘤血管生成，長期使用有可能會影響正常情況下如傷口愈合期、女性月經期和妊娠期的血管生成；且TAI只是抑制腫瘤的生長，不能徹底殺死腫瘤細胞，停藥后腫瘤即可恢復生長。因此，必須將它與放療、化療及介入療法等相結合，以達到最佳的治療效果。近年來，發(fā)現許多中藥的有效成分能抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，如：姜黃素、雷公藤紅素、