基因治療進(jìn)展及其在心血管疾病中的應(yīng)用

1、    基因治療進(jìn)展及其在心血管疾病中的應(yīng)用        中分類號(hào)：R54;R454.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3934（2000）04-0211-04Advance in Gene Therapy and it'sImplication in Cardiovascular DiseaseHUA Jun-yi,ZEN Zhi(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of West China U

2、niversity of Medical science,SichuanChegndu610041)隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的進(jìn)展，特別是在載體的構(gòu)建、靶基因的界定和活體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)等方面所取得的重要進(jìn)展，使許多因基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常引起的心血管疾病利用基因治療可獲得根治。自1992年人類首次成功地應(yīng)用低密度脂蛋白受體基因治療家族性高膽固醇血癥，揭開了心血管疾病基因治療的序幕，近十年時(shí)間內(nèi)，心血管疾病基因治療取得了一系列令人矚目的成就。本文就基因治療方法學(xué)及其在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。1基因治療方法學(xué)及進(jìn)展1.1基因治療的概念：基因治療指將正常和野生型的基因插入靶細(xì)胞的染色質(zhì)基因組中，以

3、補(bǔ)充缺失基因或置換致病基因，從而產(chǎn)生新的表型的一種治療方法?；蛑委煴仨毦邆淠康幕?、靶細(xì)胞以及將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法。同時(shí)，目的基因的表達(dá)及對(duì)此表達(dá)的調(diào)控亦是不可缺少的重要條件。基因治療最初用于某些先天性缺陷病，然而，基因治療方法已不僅僅局限于此，還廣泛適用于艾滋病（AIDS）、惡性腫瘤、心血管病等。1.2基因治療的基本類型：分體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因治療和間接的細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療2種基本類型。直接轉(zhuǎn)基因治療，又稱一步法，不需要對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行體外操縱，而是將含有目的基因的載體甚至裸露DNA直接轉(zhuǎn)導(dǎo)入體內(nèi)。目前缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率尚不高，需一套特異性定位轉(zhuǎn)導(dǎo)方法以免基因在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中播散。間接法則是

4、先從宿主體內(nèi)提取靶細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)染含有目的基因的載體如病毒，再利用遺傳特性進(jìn)行篩選，最后將獲得外源基因的靶細(xì)胞植回體內(nèi)，發(fā)揮治療作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，但需要分兩步進(jìn)行，又稱兩步法。1.3載體的構(gòu)建：雖然裸露脫氧核糖核酸（DNA）對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)心肌細(xì)胞尚有效，但對(duì)大多數(shù)其他類型細(xì)胞無效。因此，構(gòu)建安全、有效的載體至關(guān)重要。逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒是常用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。前者優(yōu)勢(shì)在于可轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞，并能直接整合到宿主基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，缺點(diǎn)是宿主細(xì)胞須處于分裂期及由于啟動(dòng)子隨機(jī)插入有激活原癌基因的可能性。腺病毒載體對(duì)分裂期和非分裂期細(xì)胞均能轉(zhuǎn)導(dǎo)，不整合入宿主基因組中，缺點(diǎn)是由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的同時(shí)也表達(dá)腺病毒結(jié)構(gòu)

5、蛋白，可招致免疫攻擊而使外源基因只能短暫表達(dá)，一般僅能持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，從而限制了反復(fù)轉(zhuǎn)染的有效性。另外，某些靶細(xì)胞缺少腺病毒受體也是腺病毒載體的一個(gè)缺點(diǎn)1。目前又構(gòu)建了低免疫原性的第二代腺病毒載體及幾種抑制宿主免疫的方法2。其他病毒載體如重組腺病毒相關(guān)載體，可將病毒編碼的蛋白全部缺失，只保留長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），無病原性，安全性高，應(yīng)用宿主范圍廣泛，適用于分裂及非分裂細(xì)胞，并可整合入宿主染色體上特定位點(diǎn)，長(zhǎng)期表達(dá)目的蛋白，缺點(diǎn)是制作復(fù)雜，可插入外源片段過?。?kb）。還有人類單純皰疹病毒，對(duì)神經(jīng)組織有特異親和力，可插入外源片段大（4050kb），但有較高的細(xì)胞毒性。近來構(gòu)建的慢病毒載體，既

6、能同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一樣可穩(wěn)定表達(dá)靶基因，又能同腺病毒載體一樣可同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期和非分裂期細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染相對(duì)安全，具有較低的免疫原性，載入DNA的分子大小不受限制，同時(shí)適用于分裂和非分裂細(xì)胞，制作簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)染效率較低，有些脂質(zhì)分子對(duì)細(xì)胞有一定毒性。目前正努力研究如何提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率。有報(bào)道結(jié)合型抗E-選擇素抗體脂質(zhì)體對(duì)激活的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是非激活內(nèi)皮細(xì)胞的275倍3。還可利用脂質(zhì)體病毒集合物構(gòu)建的復(fù)合型載體，可同時(shí)兼顧脂質(zhì)體的安全性和病毒載體的高效率，如Dzan等發(fā)展的融源性病毒脂質(zhì)體載體利用日本血凝病毒可與細(xì)胞融合的特點(diǎn)，使DNA易于直接導(dǎo)入細(xì)胞，避免在溶酶體內(nèi)降解，

7、從而提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率?？傊?，一個(gè)理想的載體應(yīng)該安全、有效、具有組織細(xì)胞特異的親和力，基因在一段時(shí)間內(nèi)能夠有效表達(dá)并具有可控性。因而目前有學(xué)者從事發(fā)展能隨意控制目的基因表達(dá)水平的載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特異性的載體。我們相信，理想載體的構(gòu)建在基因轉(zhuǎn)移領(lǐng)域仍將是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。1.4基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法學(xué)：對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)活體血管的研究主要集中在冠脈、頸動(dòng)脈、肢體血管的轉(zhuǎn)導(dǎo)。大多數(shù)通過導(dǎo)管系統(tǒng)行血管腔內(nèi)定位導(dǎo)入。如雙囊導(dǎo)管系統(tǒng)和改良的多孔灌注氣囊導(dǎo)管。這種血管基因轉(zhuǎn)移有以下缺點(diǎn)：（1）除內(nèi)皮外，動(dòng)脈壁其他部位如中膜、外膜的轉(zhuǎn)移效率低下。若通過氣囊或管內(nèi)給予高壓損傷內(nèi)膜，提高中膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率就會(huì)影響對(duì)血管反應(yīng)性的研究，因?yàn)橥?/p>

8、整的內(nèi)膜對(duì)正常血管功能必不可少。（2）血流稀釋影響轉(zhuǎn)移效率，若用雙囊導(dǎo)管基因轉(zhuǎn)移則需要阻斷血流數(shù)分鐘，限制了對(duì)心腦血管行此操作。（3）基因轉(zhuǎn)移僅局限于一小段血管。近年來發(fā)展了血管周圍基因轉(zhuǎn)移法可克服以上缺點(diǎn)。向動(dòng)脈鞘內(nèi)注射含目的基因的腺病毒載體可使目的基因在動(dòng)脈外膜獲得表達(dá)4。近年體外轉(zhuǎn)基因研究顯示將基因?qū)雱?dòng)脈外膜能有效改變血管反應(yīng)性5。這種基因轉(zhuǎn)移方法可保持血管內(nèi)皮完整性及轉(zhuǎn)導(dǎo)部位較高濃度的表達(dá)載體，除血管外膜和平滑肌層外，內(nèi)皮細(xì)胞也能被不同程度的轉(zhuǎn)化。國(guó)外還有學(xué)者將含有目的基因的腺病毒載體注入鼠腦脊液（CSF）中以期轉(zhuǎn)化顱內(nèi)血管6。如將含有NOS基因的載體注入CSF中后，NOS基因可在血

9、管外膜和管周腦脊液中表達(dá)，產(chǎn)生的NO可高度自由擴(kuò)散，使附近腦血管擴(kuò)張。將含有白介素-1（IL-1）受體拮抗蛋白基因的重組腺病毒注入CSF中，CSF和腦中IL-1受體拮抗蛋白濃度增加550倍，可使大腦中動(dòng)脈閉塞24小時(shí)的梗塞發(fā)生率減少64%7?；铙w基因轉(zhuǎn)移心臟被視為將來基因治療心臟疾病的重要方法，其是將含有外源基因的重組病毒載體、脂質(zhì)體或裸露DNA直接導(dǎo)入活體心臟內(nèi)，可提高局部心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率。因開胸手術(shù)法難以被廣泛接受，所以可采用靜脈注射法、經(jīng)胸壁注射法、冠脈內(nèi)灌注法、經(jīng)皮導(dǎo)管心肌注射法。其中靜脈注射法最為簡(jiǎn)便，但載體用量大，缺乏轉(zhuǎn)移的定位性，主要用于基礎(chǔ)研究。亦可以在載體中選用心肌細(xì)胞特定的

10、啟動(dòng)子或心肌細(xì)胞特異性配體使外源基因局限在心肌內(nèi)表達(dá)。經(jīng)胸壁注射法具有操作簡(jiǎn)便，但可致心肌機(jī)械損傷的特點(diǎn)。冠脈注射法是用普通動(dòng)脈導(dǎo)管將外源基因載體注入冠脈口，該法簡(jiǎn)便、可靠、無傷，但仍有一定程度的心臟外組織非特異表達(dá)。經(jīng)皮導(dǎo)管注射法是將尖端附有針頭的注射導(dǎo)管插入左心室壁，并注入含有外源基因的載體，也可引起一過性局部心肌炎癥反應(yīng)。還有學(xué)者將腺病毒載體導(dǎo)入心包8，導(dǎo)入的目的基因可表達(dá)蛋白產(chǎn)物釋入心包液中。設(shè)想如果這種蛋白產(chǎn)物是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，心臟浸浴在這樣的心包液中，就有可能促進(jìn)心包臟層下心肌側(cè)支血管形成，為活體基因轉(zhuǎn)移心臟開辟了一條新途徑。近年又創(chuàng)建了基因縫線、基因電針、基因支架、基因氣囊

11、導(dǎo)管等新的直接基因轉(zhuǎn)移法9。2心血管疾病基因治療應(yīng)用前景目前心血管病基因治療尚處于不成熟階段。其一，相對(duì)腫瘤等其他疾病而言，心血管病的基因治療的風(fēng)險(xiǎn)/受益比較高；其二，大多數(shù)心血管病是多基因異常，因而對(duì)導(dǎo)致心血管疾病的靶基因的界定較困難。但隨著基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和反義技術(shù)的進(jìn)步，將有更多的潛在靶基因被人們認(rèn)清，相信基因治療心血管病具有廣闊前景。2.1家族性高膽固醇血癥（FH）：是人類首次將基因治療應(yīng)用于臨床的成功例子。在FH動(dòng)物模型中，用二步法將人低密度脂蛋白受體（LDL-R）基因?qū)塍w外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，再將肝細(xì)胞回輸?shù)絼?dòng)物體內(nèi)，可使血漿膽固醇水平顯著下降10。對(duì)人體用同樣的方法可使血漿LDL濃度顯著

12、降低17%，并保持18個(gè)月11。近年來還發(fā)展了用直接法導(dǎo)入目的基因來糾正動(dòng)物模型的高膽固醇血癥。如用腺病毒載體將含有編碼人類apoAI的目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)正常小鼠可增加循環(huán)中的高密度脂蛋白（HDL）12，但基因表達(dá)水平迅速下降，轉(zhuǎn)導(dǎo)12天后降至峰值的10%以下。對(duì)某些疾病而言，短暫表達(dá)可能已足以產(chǎn)生治療作用，但對(duì)一些慢性疾病如高膽固醇血癥，外源基因的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)發(fā)揮長(zhǎng)期治療作用是非常關(guān)鍵的。目前還界定了其他一些防治脂代謝異常的候選基因，如極低密度脂蛋白受體（VLDL-R）基因可加速肝對(duì)VLDL的攝??；膽固醇7-羥化酶基因可將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸；載脂蛋白（apo)BEC-I基因可減少apoB 100生成

13、，降低脂蛋白a（LPa）水平；卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）基因促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等。2.2PTCA術(shù)后再狹窄及抗血管內(nèi)膜增生：成功的PTCA術(shù)后冠脈再狹窄發(fā)生率約30%50%，可能是血管重構(gòu)的結(jié)果，包括平滑肌細(xì)胞激活、增生、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)合成。全身給藥防治再狹窄療效很差，因而研究重點(diǎn)放在對(duì)PTCA術(shù)后血管壁的局部治療，可通過特制的導(dǎo)管向PTCA術(shù)后局部血管注藥，將反義寡核苷酸導(dǎo)入局部損傷的血管，可抑制平滑肌細(xì)胞增殖，使用反義技術(shù)抑制血管內(nèi)膜增殖，抑制的靶基因常為原癌基因，這些基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活和增殖。如將c-myb13或c-myc14反義寡核苷酸鏈導(dǎo)入血管受損部位可以抑制平滑肌細(xì)胞（S

14、MC）聚積增殖。另一種防治再狹窄的方法是在血管局部轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)基因以抑制內(nèi)膜增殖。目的基因的表達(dá)可能只是暫時(shí)的（數(shù)周時(shí)間），但對(duì)防治血管再狹窄仍有效。研究表明，再狹窄多發(fā)生在血管受損早期，數(shù)周到數(shù)月病變恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)。如腺病毒介導(dǎo)ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變基因，腺病毒介導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白R(shí)b基因，導(dǎo)入球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈可顯著減少內(nèi)膜增厚和中層細(xì)胞增殖15。腺病毒介導(dǎo)生長(zhǎng)終止同源盒基因，導(dǎo)入球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈可顯著減少新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄16。HVJ-脂質(zhì)體介導(dǎo)NO合酶基因可使球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜質(zhì)量減少70%17。腺病毒介導(dǎo)的RB2/P130基因轉(zhuǎn)移，可抑制大鼠頸動(dòng)脈平滑肌增殖和防止血管成

15、形術(shù)后再狹窄18。2.3預(yù)防血栓形成：基因治療方法有助于提高人造移植血管和內(nèi)支架的有效率，移植前在人造血管和內(nèi)支架表面覆蓋一層基因工程處理過的內(nèi)皮細(xì)胞。如將人組織纖溶酶原激活物（t-PA）基因?qū)雰?nèi)皮細(xì)胞，并將其覆于內(nèi)支架表面，局部的t-PA可減少支架血栓形成率。還有學(xué)者將血管粘附分子（VCAM）基因?qū)胴i頸靜脈，并將其移植插入豬頸動(dòng)脈上，通過抑制單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞從而防止早期移植物血栓形成19。2.4心肌梗死和促進(jìn)側(cè)支循環(huán)：對(duì)于某些嚴(yán)重血管功能不全的病人，血管再通非常困難，此時(shí)促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成對(duì)維持組織灌注很有意義。用重組型血管形成生長(zhǎng)因子用于缺血?jiǎng)游锬Ｐ涂纱龠M(jìn)側(cè)支動(dòng)脈形成。如將血管

16、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因轉(zhuǎn)移缺血?jiǎng)用}壁中，可促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成。國(guó)外已有人將VEGF基因利用氣囊導(dǎo)管定向轉(zhuǎn)移阻塞的動(dòng)脈壁20。同理，將具有促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)形成的血管新生因子基因如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、VEGF基因?qū)胄呐K可增加冠脈側(cè)支循環(huán)，減少心肌缺血或壞死。心肌梗死后，將肌源性決定基因（myoD）導(dǎo)入成纖維細(xì)胞，可使成纖維細(xì)胞肌源化，恢復(fù)收縮功能21，可能為心肌梗死區(qū)提供收縮組織，以期改善心功能。2.5心功能不全：是大多數(shù)心血管疾病的終末階段，如果能加以基因干預(yù)，達(dá)到阻斷心功能惡化的目的，將會(huì)對(duì)心血管疾病治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。鑒于心衰時(shí)出現(xiàn)的心肌細(xì)胞肥大、收縮功能下降和成纖維細(xì)胞相對(duì)增

17、多，可用轉(zhuǎn)基因方法使成纖維細(xì)胞肌源化并恢復(fù)收縮功能；另外，依據(jù)心衰時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)，可用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入這些致病因子的拮抗物基因以逆轉(zhuǎn)心衰惡化。如用轉(zhuǎn)基因方法控制心衰時(shí)心肌內(nèi)過度表達(dá)的腫瘤壞死因子-（TNF-）對(duì)病情有利22。2.6高血壓：基因治療已成為高血壓病治療的新途徑，并有著較好的前景。高血壓病的形成和發(fā)展?fàn)可嬉蛩貜?fù)雜，候選基因較多。用抗血管緊張素原（AGT）基因有望治療高血壓病23。Ambuhl用抗血管緊張素受體亞型-1（AT-1）mRNA的反義寡核苷酸治療鼠高血壓獲得成功。還可通過調(diào)控心鈉素基因入手24。用針對(duì)內(nèi)皮素或其受體mRNA的反義寡核苷酸以及調(diào)控NOS基因治療高血壓可能有效25

18、。另外，激肽釋放酶基因參與血壓調(diào)控，亦可能作為候選基因治愈高血壓病26。問題與展望心血管疾病基因治療在過去10年取得了令人矚目的成就，但大多數(shù)仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)向臨床應(yīng)用的過渡階段，距離廣泛應(yīng)用于臨床這一既定目標(biāo)還很遠(yuǎn)。主要存在的問題是：（1）靶基因的界定：是心血管疾病治療的前提，只有對(duì)心血管疾病的分子生物學(xué)機(jī)制有了誘徹了解，明確了發(fā)病的關(guān)鍵基因和相關(guān)基因，才有可能從基因水平診治心血管疾病，而多數(shù)心血管疾病是多基因異常，這就給我們對(duì)靶基因的界定和選擇帶來了一定困難；（2）載體構(gòu)建：構(gòu)建安全、高效、免疫原性低的載體是基因治療的一大熱點(diǎn)；（3）基因轉(zhuǎn)移法：建立安全有效的基因?qū)敕椒ㄒ埠荜P(guān)鍵，一般而言，

19、直接基因轉(zhuǎn)移法優(yōu)于間接法。新近創(chuàng)建的雙囊導(dǎo)管血管內(nèi)定位輸送、血管外膜轉(zhuǎn)基因法、基因縫線、基因支架等直接轉(zhuǎn)移法是基因轉(zhuǎn)移方法的一大進(jìn)展。相信，隨著分子生物學(xué)和分子病理學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，人們會(huì)發(fā)現(xiàn)心血管疾病更多的靶基因，構(gòu)建出更加合理的載體，創(chuàng)建出更加巧妙的基因?qū)敕椒?，使心血管疾病的根治不再只是?mèng)想。華軍益（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，四川成都）曾智（華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，四川成都） 參 考 文 獻(xiàn) 1Zabner J,Freimuth P,Puga A,et al.Lack of high affinity fiber receptor activity explains th

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