第五章減壓柱色譜分離技術(shù)

1、第五章第五章減壓柱色譜減壓柱色譜分離技術(shù)分離技術(shù)為加快柱分離的速度和/或增加分離度，通常采用在柱前加壓和柱后減壓的方法進(jìn)行柱層析與分離。柱前加壓法通常稱為加壓柱色譜柱后減壓法通常稱為減壓柱色譜第一節(jié)第一節(jié)真空液相色譜技術(shù)真空液相色譜技術(shù)VacuumLiquidChromatography第二節(jié)第二節(jié)半干柱液相色譜半干柱液相色譜Semi-DryColumnChromatographySDC第一節(jié)第一節(jié)真空液相色譜技術(shù)真空液相色譜技術(shù)VacuumLiquidChromatography真空液相色譜法，簡(jiǎn)稱VLC，也稱減壓液相色譜法。是近幾年來國(guó)外實(shí)驗(yàn)室迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，它是利用柱后減壓使洗脫劑

2、迅速通過固定相從而很好的分離樣品的色譜技術(shù)。VLC具有快速，簡(jiǎn)易，高效，價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功的應(yīng)用于有機(jī)制備以及天然產(chǎn)物如萜類，類酯，雙萜及多種生物樣品的分離。由于經(jīng)典的柱層析費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要大量的固定相和洗脫液，工作效率低，為此人們相繼建立了離心薄層、VLC、FCC等快速層析分離的方法。其中VLC在天然產(chǎn)物分離中應(yīng)用最多。該法1969年由澳大利亞CollJ.C提出，1977年首次應(yīng)用于分離澳洲軟珊瑚中2個(gè)新的二萜化合物(Cembrenoids).1979年美國(guó)Targett.NM將該法命名為Vacuumliquidchromatography(VLC),并且詳細(xì)報(bào)道了實(shí)驗(yàn)裝置和操作方法。從此

3、以后，VLC便逐漸為廣大化學(xué)家所接受，并且在實(shí)驗(yàn)裝置上作了進(jìn)一步改進(jìn)。一、一、VLC特點(diǎn)特點(diǎn)V L C 實(shí) 質(zhì) 上 是 柱 色 譜 ， 它 綜 合 了 制 備 薄 層（PreparativePTLC）和真空抽濾技術(shù)。VLC不同于常壓柱層析和快速柱層析Fcc，因?yàn)楹髢烧呦疵搫┦沁B續(xù)的，在操作中不會(huì)間斷；而VLC進(jìn)行溶劑洗脫時(shí)，在加洗脫劑后，在柱后減壓下全部抽出，每一次洗脫收集一次，抽干后，再更換溶劑，并再進(jìn)行下一個(gè)流分的收集，所以在這一點(diǎn)上VLC與PTLC多次展開極為相似。（展開一次后吹干，再展）。FCC采用柱前加壓，而VLC采用柱后加壓。VLC可分離樣品量達(dá)幾十克，而FCC只能分離幾克。VLC

4、吸附劑經(jīng)處理后可反復(fù)使用。二、實(shí)驗(yàn)裝置與操作二、實(shí)驗(yàn)裝置與操作1986年，Coll和Bowden曾介紹過一種十分簡(jiǎn)單的用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的減壓液相色譜法裝置（圖a,b）。Pelletier在1986年，介紹可使用于較大規(guī)模的分離的裝置（圖2）1.固定相；常采用TLC用硅膠、Al2O3,（粒度：10um40um硅膠60H或60G）聚酰胺等2.裝柱：干法裝柱法。將吸附劑裝入漏斗或短柱中，輕輕拍緊或減壓拍打或從頂端擠壓，直至吸附劑緊密，最后變得堅(jiān)硬。吸附劑的高度一般不超過5cm。3，吸附劑用量：（1）對(duì)于微量分離，樣品100mg,可采用直徑為0.51cm色譜柱或漏斗，吸附劑高度為5cm，一般固定相用量

5、為1015：1倍，如圖4-a,可在小試管中收集流分。（2）對(duì)于0.51.0g樣品，柱中裝有2.54cm高度的吸附劑較合適。（3）對(duì)于110g樣品的分離，可在柱中裝入55cm的吸附劑。（4）較大樣品分離，最好采用250ml砂芯漏斗中進(jìn)行。吸附劑的高度為5cm。（如圖b）可用三角燒瓶收集之。加大吸附劑與樣品比例，可提高分離度。常用比例為30：1300：1三、上樣三、上樣放掉真空后，常壓下加入低極性溶劑于吸附劑表面上，減壓使溶劑均勻流過吸附劑。如有空隙，需要重裝。使柱子抽干后，重復(fù)12次，即可準(zhǔn)備上樣。A用低極性溶劑或洗脫劑（如石油醚、用低極性溶劑或洗脫劑（如石油醚、正己烷）溶解樣品正己烷）溶解樣品

6、。常壓下小心加入柱頂端，再加入洗脫劑或溶劑覆蓋吸附劑表面，慢慢減壓，使樣品在柱頂端形成樣品層。B可也采用固體上樣法可也采用固體上樣法。即先將樣品溶于極性溶劑，加入510份吸附劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加到吸附劑的表面上，然后進(jìn)行洗脫。四，四，VLC流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇與柱層析相同，先用TLC來選擇條件。VLC更適用于梯度洗脫，可用二元，三元混合溶劑系統(tǒng)。一般先用極性較小溶劑，如石油醚、正己烷、環(huán)己烷，然后逐漸加大極性（CH2Cl2、Et2O、AcOEt、CH3OH）極性溶劑的增加開始要緩慢（1%，2%，3%等），然后增加的幅度可逐漸增大（5%10%20%等），通常收集2025個(gè)流分可將所有成分洗脫。

7、五、洗脫與收集五、洗脫與收集用適當(dāng)溶劑系統(tǒng)洗脫或用梯度洗脫（gradientelution）。在常壓下，加入溶劑后，將柱抽干，收集為一個(gè)流分。真空度要求2070mmHg；抽干后再更換溶劑和容器，重復(fù)以上操作，并用TLC跟蹤每一個(gè)流分的分離情況（先摸一摸再行動(dòng)）。為避免每一流分拆卸漏斗，可采用圖B的方法，該抽濾甁底部為磨口，減去負(fù)壓后，更換接受甁。六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例1.VLC法可用于合成反應(yīng)混合物的分離法可用于合成反應(yīng)混合物的分離delphinine(翠雀花堿)于220，01mmHg下發(fā)生裂解反應(yīng)，生成Pyrodelphine(焦翠雀靈)兩者的混臺(tái)物用甲苯：丙酮24：1洗脫，得到896mg

8、Pyrodelphinines;甲苯：丙19：1洗脫，得到108mgDelphinine分離全程僅僅花費(fèi)2小時(shí)2.VLC法用于多種天然化合物的分離法用于多種天然化合物的分離（1）曾有人用）曾有人用VLC法對(duì)姜中辛辣成分的分離法對(duì)姜中辛辣成分的分離先將冷凍干燥的姜粉用丙酮提取，經(jīng)過一系列溶劑分先將冷凍干燥的姜粉用丙酮提取，經(jīng)過一系列溶劑分配后，得所需部位。配后，得所需部位。選用一內(nèi)徑為選用一內(nèi)徑為3.5cm的的100ml的布氏漏斗內(nèi)裝硅膠的布氏漏斗內(nèi)裝硅膠60（4063m,Merck公司）公司）9.5g,高度高度3cm.300mg姜提取物的溶液與硅膠姜提取物的溶液與硅膠60混和，蒸發(fā)除去溶劑混和

9、，蒸發(fā)除去溶劑后，均勻分布于硅膠柱床表面上，并在樣品表面上覆后，均勻分布于硅膠柱床表面上，并在樣品表面上覆蓋一張與漏斗內(nèi)徑相同的濾紙，緩緩加入蓋一張與漏斗內(nèi)徑相同的濾紙，緩緩加入25ml的己烷。的己烷。待溶劑透過柱床后，開始減壓抽干柱床，得第一流分。待溶劑透過柱床后，開始減壓抽干柱床，得第一流分。繼續(xù)用極性增大的溶劑（己烷乙醚乙醚甲醇）繼續(xù)用極性增大的溶劑（己烷乙醚乙醚甲醇）洗脫，每份洗脫，每份25ml，共得共得20份洗脫液，利用該法可將姜份洗脫液，利用該法可將姜醇與姜烯酚完全分開。醇與姜烯酚完全分開。（2）l0克pH9-12的Acontiumcolumbianum粗提生物堿混合物，使用65g

10、TLC用Al2O360(Merck,Hbasic,TypeE，EM1085)甲苯：氯仿1：4(VV)洗脫，于28-30號(hào)流份中得到talatizamine(3)265mg;氯仿:甲醇19：1洗脫，于35-36號(hào)流份中分離得到cammaconine(4)247mg。從兩個(gè)化臺(tái)物結(jié)構(gòu)來看，只是在C18位上有細(xì)微差別若采用PTLC法分離，操作極其繁瑣、費(fèi)時(shí)，且消耗大量吸附劑與展開劑兩法相比，VLC明顯優(yōu)于PTLC（3）利用VLC成功分離海洋腔腸動(dòng)物的正己烷提取物將在日本沖繩近海采集到的一種軟珊瑚腔腸動(dòng)物Anemoniasulcatas切碎后用丙酮浸出，浸液濃縮后用正己烷提取，得提取物12.5g,溶解

11、于70ml正己烷：乙酸己酯8：2的混合溶劑，用滴管將此溶液均勻添加到硅膠表面抽真空，洗脫溶劑從正已烷開始，直至最后用乙酸乙酯，梯度洗脫，每次收集200mL，共收集2L，耗時(shí)2小時(shí)結(jié)合TLC和核磁共振譜，非常滿意地分離和確定了10余種萜類、脂肪酸及其酯、甾體化臺(tái)物(見圖)若用常壓柱層橋，需要370g硅膠，費(fèi)時(shí)30小時(shí)，耗用10L溶劑，才得到同樣的效果七七.小小結(jié)結(jié)綜上所述，與常壓柱層析和快速柱層析相比，真空柱層析具有以下特點(diǎn)：a分離操作時(shí)間短，一般僅需數(shù)個(gè)小時(shí)，b裝置簡(jiǎn)單、易得，裝柱方便，且要求不高，c分離效果好，這主要是由于固定相的細(xì)小顆粒(平均10m)、較大的表面積(500m2/g)和合理的

12、裝柱方法的原因，dVLC處理量大分離幾十克的樣品，仍能以較快的速度完成。在FCC中，由于玻璃分離柱的限制，處理6g以上的樣品時(shí)就常困難常壓柱層析雖然沒有樣品量的限制，但是極其耗時(shí)，所用的固定相的量亦很大，e.VLC特別適用于頻繁的梯度淋洗，并可使固定相抽干，這又是FCC和常壓柱層析無法做到的，fVLC可以作為進(jìn)行HPLC分離前的較理想的預(yù)處理方法VLC法也有不足在使用低沸點(diǎn)溶劑(如石油醚)時(shí)要嚴(yán)格控制好真空度，防止大劑量溶劑揮發(fā)。第二節(jié)第二節(jié)半干柱液相色譜半干柱液相色譜Semi-DryColumnChromatographySDC半干柱液相色譜半干柱液相色譜即在柱后減壓時(shí)將固即在柱后減壓時(shí)將固

13、定相抽之半干的液相色譜。定相抽之半干的液相色譜。PeterVinezev等1991年報(bào)道利用半干柱液相色譜法對(duì)Wittig反應(yīng)中的差向異構(gòu)體的分離。一、色譜柱的制備一、色譜柱的制備應(yīng)用砂芯漏斗或短層析柱，裝入1：1硅膠60（70230目）與硅膠HF（薄層層析用規(guī)格）的混合物。硅膠床的高度5-8cm，再高對(duì)分離結(jié)果無明顯提高。對(duì)于較大量樣品的分離可用較大的砂心漏斗，同樣可以得到較好的分離效果。有關(guān)SDC的實(shí)際操作數(shù)據(jù)包括漏斗直徑，裝入硅膠量，每一洗脫劑量及被分離樣品的關(guān)系見表：IIIIIIIVV漏斗直徑200120906540packing：硅膠6070230目5002001003010硅膠HF5002001003010每一流分體積1608060308樣品量（g）30501030110150.11二、洗脫與分離二、洗脫與分離：1.首先用洗脫劑流經(jīng)吸附劑，抽濾至近干，約有1滴/12秒洗脫液流下。或用濕潤(rùn)的硅膠裝柱，吸濾至干，再加40體積的濾液到漏斗中，抽至與吸附劑一直的水平面下。2.樣品溶