蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白原料的研究

1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白原料的研究姓名：王朋朋申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)指導(dǎo)教師：尹清強20100601河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩二：論文摘要蛋白質(zhì)飼料資源的不足已成為世界性問題，在我國尤其嚴(yán)重。隨著畜牧業(yè)的高速發(fā)展，常規(guī)蛋白飼料已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足畜牧業(yè)發(fā)展的需要，開發(fā)新的飼料蛋白資源成為我國飼料業(yè)的重要課題。采用微生物固態(tài)發(fā)酵非常規(guī)蛋白飼料生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料是國內(nèi)外研究的主要方向。本研究試圖從牛瘤胃中分離篩選出高產(chǎn)以蛋白酶為主并產(chǎn)多種復(fù)合酶的菌株，采用固態(tài)發(fā)酵的方法，發(fā)酵非常規(guī)蛋白原料（血粉、棉粕、羽毛粉），并進(jìn)行代謝試驗。本研究主要包括如下四部分內(nèi)容

2、：試驗一，發(fā)酵菌種的分離與篩選：采用干酪素培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，從牛瘤胃內(nèi)容物中分離和篩選出株產(chǎn)透明圈較人的菌株，利用它們發(fā)酵乍常規(guī)蛋白原料，最終確定菌株具有高效的發(fā)酵能力。利用固態(tài)發(fā)酵非常規(guī)蛋白原料，使可溶性蛋白質(zhì)含量提高了，氨基氮含量提高了倍，并且該菌高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為米曲霉。試驗二，米曲霉同態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究：以中性蛋白酶的活性為優(yōu)化指標(biāo)，采用正交和單因素方差分析的方法，對米曲霉最適產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的最適培養(yǎng)基組成為：在麩皮：豆粕粉為：的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加、：，培養(yǎng)基的含水率為。產(chǎn)酶最適培養(yǎng)條件為

3、：值為，接種量為，的三角瓶裝干的培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)時間為。該酶的最適反應(yīng)溫度為，最適值為；該酶在較穩(wěn)定，值在時比較穩(wěn)定；、對該酶有激活和穩(wěn)定作用，而、不同程度的抑制酶活性，其中強烈抑制酶的活性。在最佳發(fā)酵工藝下，蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活力分別為、。試驗三、米曲霉同態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料工藝的優(yōu)化：本試驗采用正交及單因素方差分析的試驗方法，以可溶性蛋白含量、氨基氮含量及酶活為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評定，篩選出最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件。試驗研究結(jié)果顯示，最佳原料配方為：血粉、棉粕、羽毛粉、麩皮、玉米粉；最佳發(fā)酵條件：初始為，含水率為，接種量為，發(fā)酵時間為。在最佳發(fā)酵：藝的條件下，發(fā)酵產(chǎn)品的可溶性

4、蛋白含量、氨基氮含量、粗蛋白含量及游離氨基酸總量分別達(dá)到了、，比未發(fā)酵的產(chǎn)品分別提高了、；蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的活力分別為。由此可見，利用米曲霉司態(tài)發(fā)酵非常規(guī)蛋白原料可以明顯提高它們的利用率，為解決當(dāng)前蛋白飼料資源的不足提供重要的理論依據(jù)。試驗四，發(fā)酵蛋白替代豆粕對從肉雞日糧代謝率、腸道菌群及消化酶活性的影響：按河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩二論文照體重、身體狀況，把周齡的肉雞隨機(jī)分成五組，每組只，分別為對照組、發(fā)酵雜蛋白組（試驗、組的發(fā)酵雜蛋白分別替代全價料中豆粕的、）、未發(fā)酵雜蛋白組（試驗組的未發(fā)酵雜蛋白替代全價料中豆粕的、）。研究結(jié)果表明：與對照組相比，試驗、組（發(fā)酵蛋白組）的營養(yǎng)物質(zhì)的表觀代謝率差

5、異不顯著（），對腸道中乳酸菌的數(shù)量影響不顯著（）；但可以顯著提高腸道中米曲霉的數(shù)量，顯著降低腸道中大腸桿菌的數(shù)量（），顯著提高小腸中消化酶的活性（）。與試驗組（未發(fā)酵蛋白組）相比，使用發(fā)酵蛋白能顯著提高肉雞臼糧中粗蛋白、鈣、磷的表觀代謝率（），腸道中米曲霉和乳酸菌的數(shù)量顯著增加，大腸桿菌的數(shù)量降低（），并能顯著提高小腸中消化酶的活性（）。關(guān)鍵詞：蛋白酶；固態(tài)發(fā)酵；米曲霉；肉雞；蛋白資源河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩上論文：，：，：，；：，；”，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩上論文，：，；，（），：（），（，），（）（，），（）；，（）（，），（）；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩論文（）（）：；致謝本論文從選題、思路設(shè)計、實驗方法、試驗的開展

6、到論文的撰寫都是在導(dǎo)師尹清強教授的精心指導(dǎo)下完成的，取得的每一點成果無不凝聚著尹老師的智慧和汗水。尹老師淵博的學(xué)識、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、敏銳創(chuàng)新的科研思路和不斷開拓進(jìn)取的科學(xué)精神使我受益匪淺，也將是我人生中永遠(yuǎn)的航標(biāo)。三年來，恩師不僅在學(xué)業(yè)上給予了始終如一的精心教誨和指引，在生活方面也對我關(guān)心備至，他是我人生旅途上最重要的啟蒙者和領(lǐng)路人。從他身上我不但學(xué)到了很多專業(yè)知識，更重要的是為人處事的態(tài)度和方法。師恩似海，永生難忘。在此論文完成之際，謹(jǐn)向?qū)熞鍙娤壬乱宰畛绺叩木匆夂妥钪孕牡母兄x！本試驗在具體操作、課題討論、試驗內(nèi)容的安排及實施方面得到了師母鄭秋紅老師、常娟老師、師兄左瑞雨及實驗室全體同學(xué)

7、的大力幫助，有的還參與完成了本論文中的部分工作，在此對他們表示衷心的感謝！感謝他們在學(xué)習(xí)和生活中對我的關(guān)心和幫助。衷心感謝動物營養(yǎng)和飼料科學(xué)導(dǎo)師組的林東康教授、康相濤教授、王成章教授、高騰云教授、王志祥教授、李振田副教授，黃艷群副教授，陳文副教授、田亞東副教授、史瑩華副教授給我的指導(dǎo)和幫助，并對論文的開題和試驗實施提出的寶貴意見。在此，謹(jǐn)向各位老師表示衷心的感謝！衷心的感謝鄭州市佳禾生物技術(shù)有限公司的老總王衛(wèi)民及全體員工，感謝他們在我試驗過程中給予的支持和幫助！感謝父母多年來對我的撫養(yǎng)和教導(dǎo)，感謝我的女朋友張瑜多年來對我的理解與關(guān)心，是他們無私的奉獻(xiàn)和支持使我得以順利完成學(xué)業(yè)！最后謹(jǐn)將此文獻(xiàn)給

8、我的家人和所有關(guān)心、支持我的親朋好友。在我的漫漫求學(xué)路上，他們不僅在生活上無微不至地關(guān)心我、愛護(hù)我，而且在精神上給予我強大的支持和動力，正是他們一如既往的關(guān)愛使我有勇氣和信心克服重重困難與挫折，在科學(xué)研究的道路上執(zhí)著前進(jìn)。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩：論文日吾我國是世界上最大的養(yǎng)殖生產(chǎn)國之一，同時也是世界上飼料原料特別是蛋白質(zhì)原料的需求大國。隨著我國飼料工業(yè)的迅猛發(fā)展，我國對飼料原料的需求量急增，使我國的飼料資源尤其是蛋白飼料資源更加緊缺，已經(jīng)成為限制我國畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素之一。如何合理開發(fā)和利用新的蛋白飼料原料，將對我國畜牧業(yè)的發(fā)展起劍至關(guān)重要的作用。我國非常規(guī)飼料資源種類多、數(shù)量大。但它們都存在著各種

9、各樣的缺陷，若直接飼喂畜禽，其吸收利用率較低，如血粉、羽毛粉，其蛋白質(zhì)基本上都是以大分子蛋白的形式存在，難以被畜禽消化吸收。而棉籽粕（餅）、菜籽餅（粕）等因含有毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，也不能夠大量使用。因此，如何合理開發(fā)和利用這些非常規(guī)飼料原料成為世界各國研究的熱點。大量的試驗研究表明，采用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)和生產(chǎn)微生物蛋白飼料，是緩解我國優(yōu)質(zhì)蛋白飼料資源不足，發(fā)展畜牧業(yè)的一條有效途徑。利用微生物對營養(yǎng)、環(huán)境高效的適應(yīng)性和強大的轉(zhuǎn)化力來減少抗?fàn)I養(yǎng)因子及原料的毒性，并使原料中不易被動物分解吸收、利用的蛋白質(zhì)、纖維素、果膠質(zhì)、各類有機(jī)酸、淀粉等復(fù)雜大分子物質(zhì)降解為易于被動物消化吸收的小分子物質(zhì)，并形

10、成人量的菌體蛋白，大幅度提高原料的營養(yǎng)價值和利用率，并通過發(fā)酵來改善和提高飼料的適口性，促進(jìn)畜禽的采食欲；同時由于微生物本身所產(chǎn)生的各類生物活性物質(zhì)可以促進(jìn)動物體內(nèi)有益微生物菌群的生長，抑制有害菌群的繁殖，從而減少動物疫病的發(fā)生；并且微生物發(fā)酵技術(shù)在改善飼料品質(zhì)，提高原料利用率，降低飼料生產(chǎn)成本，增加畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益等方面有顯著作用。因此，本研究試圖從牛瘤胃中分離篩選出高產(chǎn)以蛋白酶為主并產(chǎn)多種復(fù)合酶的菌株并對其產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性進(jìn)行研究，然后采用固態(tài)發(fā)酵的方法發(fā)酵非常規(guī)蛋白原料，并進(jìn)行相應(yīng)的代謝試驗，為解決當(dāng)前蛋白資源不足提供一定的理論和試驗依據(jù)。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文第一章文獻(xiàn)綜述我國非常規(guī)蛋白

11、資源的現(xiàn)狀非常規(guī)蛋白質(zhì)資源的含義及特點非常規(guī)蛋白質(zhì)資源是指在傳統(tǒng)的動物飼養(yǎng)中未被作為主要蛋白質(zhì)飼料使用過以及（或）畜禽商品日糧中一般不用的蛋白質(zhì)飼料。非常規(guī)蛋白質(zhì)原料與常規(guī)蛋白質(zhì)原料相比具有如下幾方面的特點：（）來源廣泛，種類繁多，成分復(fù)雜；（）營養(yǎng)成分變異大，質(zhì)量不穩(wěn)定；（）適口性差，飼用價值低；（）含有多種抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)及毒素，需經(jīng)過特殊處理才能使用。我國常見的幾種非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料資源我國非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料資源數(shù)量大、種類多、分布廣。按來源不同可分為植物性蛋白質(zhì)飼料、動物性蛋白質(zhì)飼料、和單細(xì)胞類蛋白質(zhì)飼料等三大類。植物性蛋白飼料（）菜籽餅粕：菜籽餅柏富含蛋白質(zhì)，粗蛋白含量一般在之間，且氨基酸組成

12、與大豆餅粕近似，因此可作為畜禽極有潛力的蛋白質(zhì)飼料資源。但菜籽餅粕品質(zhì)變異較大，油菜的品種、產(chǎn)地及加工條件的變化都會引起菜籽餅粕品質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)有效性的改變。此外，菜籽餅粕含有許多有害物質(zhì)和高水平的粗纖維等，它們會對畜禽健康產(chǎn)生不利影響，從而限制了菜籽餅粕的利用。岡此，菜籽餅粕的利用要進(jìn)行合理的脫毒。菜籽餅粕的脫毒方式有酸堿處理法、氨處理法、紫外線照射法、微波處理法、坑埋法、浸泡法、蒸煮法、干熱純化酶法、菜籽餅粕與青貯玉米共同青貯法、發(fā)酵中和法及其它微生物發(fā)酵法等。這些方法中許多是通過水劑去毒，會產(chǎn)生大量含毒廢液污染環(huán)境，干物質(zhì)損失可達(dá)，但成本高，故雖有脫毒效果，但是不可行。氨、堿處理法在脫毒的同

13、時會破壞營養(yǎng)成分，飼養(yǎng)效果不好。其它方法也存在去毒效果差、不經(jīng)濟(jì)或不能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)等缺點。微生物發(fā)酵法可以明顯降低其毒性，并能顯著提高其營養(yǎng)價值，但菌種的篩選及發(fā)酵工藝仍不完善。所以，工業(yè)化的菜籽餅粕脫毒工藝及相應(yīng)的成套設(shè)備仍舊是未來幾年內(nèi)的研究重點。（）棉籽餅粕：棉籽餅是由棉籽為原料經(jīng)脫殼、去絨或部分脫殼、去絨、再取油后的副產(chǎn)品。用浸提法或經(jīng)預(yù)壓后再浸提取油后的副產(chǎn)品則稱為棉籽粕。棉籽餅柏蛋白含量一般在之間。棉籽餅粕中賴氨酸和蛋氨酸的含量均較低，缺乏維生素、，：和胡蘿卜素，富含硫胺素，磷多鈣少。主要缺乏賴氨酸，因為含量低，利用率也相應(yīng)低。一般棉籽餅中含有大量的色素腺體，如對動物有害的棉酚。

14、因此，不宜大量添加到豬和家禽的飼糧中。另外，棉籽餅及棉籽油的殘油中均含有的環(huán)丙烯類脂肪酸，它可以加重由棉酚引起的蛋黃變褐、變硬，并使蛋白呈粉紅色等。棉籽餅柏的利用與菜籽餅粕相似，都需要進(jìn)行脫毒處理。目前常用的脫毒方法有硫酸弧鐵（鐵鹽）法、化學(xué)處理法、水熱處理法、溶劑浸出法、膨化法和固態(tài)發(fā)酵法河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩士論文等。工業(yè)上常用鐵鹽法、膨化法。但最近幾年微生物發(fā)酵法的工藝和技術(shù)逐漸成熟。（）花生餅柏：花生餅粕是以脫殼后的花生仁為原料，經(jīng)取油后的副產(chǎn)品?；ㄉ炂刹缓舅兀橇己玫牡鞍踪|(zhì)飼料，精氨酸含量偏高，但是缺乏賴氨酸和蛋氨酸，當(dāng)做飼料配方時，需要進(jìn)行合理調(diào)配，才能使其成為上等的蛋白質(zhì)飼料?；ㄉ?/p>

15、粕中的礦物質(zhì)及微量元素的含量受原料、土壤地質(zhì)條件的制約。相對于其他餅粕類，花生仁餅粕中鈣、磷含量較低，總磷中的是植酸磷，難以被單胃動物吸收利用。花生餅粕不易貯存，極易感染黃曲霉而產(chǎn)生黃曲霉毒素，該毒素經(jīng)蒸煮也不能被破壞。因此，花生餅粕不宜長期儲存，一旦生有黃曲霉就不能再使用?；ㄉ炇秦i、雞的優(yōu)良蛋白質(zhì)飼料，如果與動物性蛋白質(zhì)飼料混合，效果更好。豬很喜歡吃花生餅，但花生餅中的賴氨酸和蛋氨酸不能滿足豬的需要，所以應(yīng)與其它動植物蛋白配伍使用。在豬的精料中一般不能超過，否則體脂變軟，影響肉脂品質(zhì)；肉雞和蛋雞配合飼料中可以添；。（）糟渣類：糟渣類主要是指醋糟、酒糟、醬油糟、玉米淀粉工業(yè)卜腳料、藥渣、果渣

16、、檸檬酸濾渣、甜菜渣、廢糖蜜、甘蔗渣、菌糠等。這些糟渣類除了水分含量較高之外，粗纖維、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪等的含量也較高，無氮浸出物含量較低，其粗蛋白質(zhì)約占干物質(zhì)的一以上，所以屬于蛋白質(zhì)范疇之內(nèi)。蛋白質(zhì)含量在以上，可以直接用作精飼料的如玉米蛋向粉和糟渣等，往往不需要另外處理，即可直接粉碎、干燥，制成粉狀的高蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量低，且纖維成分較高，不宜直接作為蛋白飼料的渣類我們可以做成飼料填充料；或按比例配合成營養(yǎng)劑，然后制成粉狀或顆粒狀的預(yù)混飼料出售；或者先經(jīng)過加酸加溫水解成單糖，再經(jīng)過微生物發(fā)酵制成糖化飼料或單細(xì)胞蛋白飼料。動物性蛋白飼料這類飼料主要來源于動物及其加工后的副產(chǎn)品。如血粉、羽毛粉、肉

17、骨粉等。這類飼料蛋白質(zhì)含量多在之間，且賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量車富，品質(zhì)好（評價蛋白質(zhì)品質(zhì)好壞，主要看必需氨基酸種類和含量，其中以魚粉最好）；粗纖維應(yīng)為零，但也可能混入少量植物性雜質(zhì)；粗脂肪較高，加之高蛋白含量，故能值高；鈣磷含量較高，且比例適當(dāng)。（）羽毛粉：羽毛粉的蛋白質(zhì)含量很高，大約在以上，其中羽毛粉蛋白中的含硫氨基酸的含量居所有天然飼料之首，如果制作方法合適，羽毛粉的消化率也可在以上。美國、英國和前蘇聯(lián)關(guān)于利用家禽羽毛作為蛋白飼料來源的研究已經(jīng)相繼進(jìn)行了二十多年，結(jié)果表明，羽毛蛋白是一種有獨特價值的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。我國每年可收集利用的羽毛桿下腳料約萬噸，加工后用于飼料的不足萬噸，且有下降

18、的趨勢。大部分羽毛桿等動物毛發(fā)下腳料朱被合理利用，主要原因是羽毛粉加工技術(shù)不過關(guān)、產(chǎn)品消化吸收率低、質(zhì)量參差不齊、導(dǎo)致飼養(yǎng)效果不佳等。我國羽毛粉主要采用以下幾種方法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)：高溫高壓水解法；酸、堿水解法；酶解法；微生物法等。以上方法由于工藝設(shè)備落后而效果不佳，產(chǎn)品的氨基酸消化率不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本偏高，目前比較理想的方法是通過多種微生物來發(fā)酵或是多種酶來綜合處理，這樣一方面可以提高某些氨基酸的含量，另方面也可向其中增加一些生物活性物質(zhì)。河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩士論文（）血粉：血粉是利用動物屠宰斤廢棄的血液加：而成的一種良好的動物性蛋白質(zhì)飼料。血粉中蛋白質(zhì)含量很高，達(dá)以上。但是直接采用動物血或是經(jīng)過簡單

19、風(fēng)干后的血制品來飼喂動物，其可消化性就很差，動物對其蛋白質(zhì)的吸收率不到，而且血粉中所含有的氨基酸不平衡，雖然賴氨酸含量豐富，但是蛋氨酸和異亮氨酸的含量卻較少。血粉鐵含量很高，但鈣、磷的含量卻很少。國外對血粉制品的研究頗多，例如：等瞳（）報道，由于血粉產(chǎn)品中的組分變化比較大，所以在生長豬的日糧中添加不同來源的動物血粉制品，對豬的生產(chǎn)性能，影響差異比較大。等（）報道，動物蛋白制品中的微生物尤其是沙門氏茵的含量比植物蛋白要高的多，這可能是影響血粉畜禽飼養(yǎng)效果的主要原因之一。等（）報道，血粉干燥前的貯存時間會影響血液中值的高低和血液中氨氣濃度的大小。國內(nèi)外為了提高血粉的飼用價值，曾開展了大量的開發(fā)研究

20、工作，現(xiàn)在用來改進(jìn)血粉飼用價值的主要工藝有：晾曬法、蒸煮法、噴霧干燥法、發(fā)酵血粉、膨化血粉、水解血粉和微生態(tài)血粉等。血粉作為飼料來源的潛力是巨大的，但是由于血粉的適口性差、消化率較低，故使用血粉作為畜禽飼料時以少量為宜，適宜用量人約為飼糧的。一般在豬、雞飼糧中添加量不宜超過。¨（）肉骨粉：在衛(wèi)生檢驗時，不合格的肉備屠宰體和內(nèi)臟等經(jīng)過高溫、高壓處理后，脫脂、干燥而制成的物質(zhì)，我們叫做肉骨粉。其營養(yǎng)價值的高低取決于所用的原料。肉骨粉中氨基酸含量豐富，其中賴氨酸的含量尤其豐富，但是所含的蛋氨酸比魚粉少；肉骨粉中含有豐富的營養(yǎng)元素，例如鈣、磷和維生素等。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計，我國屠宰廠（不包括個體

21、屠宰廠）下腳料每年產(chǎn)量大約三十余萬噸，如果我們能將這些動物下腳料充分合理的開發(fā)利用起來，這將是一筆很大的財富¨?，F(xiàn)在肉骨粉的處理加工方法中，比較常見的是應(yīng)用壓榨熱噴技術(shù)對肉骨粉進(jìn)行處理。此技術(shù)方法中產(chǎn)生的膨化效應(yīng)和水解作用可有效的提高產(chǎn)品品質(zhì)，增加營養(yǎng)元素的吸收率，同時又能降低有害菌指標(biāo)、消除不良?xì)馕逗推茐挠卸境煞忠约案纳七m口性等們。但值得注意的是：年月日，歐盟基本上通過了歐共體內(nèi)全面禁止使用動物肉骨粉作為飼料添加劑的決議，從年月日起，我國已禁止從歐盟國家進(jìn)口包括肉骨粉、血漿粉和動物。卜腳料以及用這些原料加：制作的各類飼料】。單細(xì)胞蛋白飼料資源單細(xì)胞蛋白又稱菌體蛋白或微生物蛋白（縮寫

22、），是指細(xì)菌、真菌或某些低等藻類生物，在其生長過程中利用各種基質(zhì)在適宜條件下，培養(yǎng)單細(xì)胞或絲狀微生物的個體而獲得的菌體蛋白，是食品工業(yè)和飼料工業(yè)的重要蛋白質(zhì)來源制。營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達(dá)；含有動物機(jī)體所必需的各種氨基酸，特別是植物飼料中缺乏的賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量較多，生物學(xué)價值大大優(yōu)于植物蛋白，其消化率高達(dá)；富含多種維生素。此外，的生產(chǎn)還具有原料來源廣、繁殖速度快、生產(chǎn)效率高、占地面積小、不受氣候影響等優(yōu)點。河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩士論文從現(xiàn)有的研究報道看，用來生產(chǎn)菌體蛋白的微生物有四人類即非致病和產(chǎn)毒的酵母、細(xì)菌、霉菌和藻類（趙健聰，）在實際生產(chǎn)中人們一般將這些菌種互相配伍，采用混菌種發(fā)酵的方式

23、進(jìn)行生產(chǎn)。其優(yōu)勢在于多個菌種之間可互相補償其缺陷，進(jìn)行協(xié)同互生發(fā)酵（張常霞，）引。菌體蛋白作為一種動物蛋白源，除了具有價格優(yōu)勢以外，還含有大量的有益菌、外源性消化酶、未知生長因子等。但是，在使用菌體蛋白作為蛋白質(zhì)飼料時，其安全性是一個非常重要的問題。目前使用的微生物菌體蛋白產(chǎn)品為多菌種的混合物，所以，對微生物菌種的監(jiān)控是保證產(chǎn)品安全的關(guān)鍵。其次，因基因重組等高新技術(shù)在菌種改良中的應(yīng)用，對該項技術(shù)的安全性評價問題有待于解決。第三，有害微生物、氫氰酸、重金屬（汞、鉛）污染也是菌體蛋白飼料安全性問題的重大隱患。另外需要注意的是，單細(xì)胞蛋白中的核酸含量過高，這會增加肝臟中嘌呤的代謝率，容易導(dǎo)致動物代謝

24、失衡和尿結(jié)石。因此，我們將單細(xì)胞蛋白作為飼料原料時，要嚴(yán)格控制其添加比例，盡可能減少單細(xì)胞蛋白所帶來的潛在危害。微生物固態(tài)發(fā)酵開發(fā)非常規(guī)蛋白原料的研究現(xiàn)狀微生物蛋白飼料的分類微生物飼料大體上可分為兩人類，一類主要是利用微生物的發(fā)酵作用改變飼料原料的理化性狀，增加其適口性，并提高消化吸收率及其營養(yǎng)價值，或解毒、脫毒，或積累有用的中間產(chǎn)物。這一類微生物蛋向飼料主要包括畜禽屠宰廢棄物發(fā)酵飼料、餅粕類發(fā)酵脫毒飼料、微生物發(fā)酵生產(chǎn)的各類飼料添加劑、乳酸發(fā)酵飼料（青貯飼料）等。另一類微生物飼料是利用來源廣泛的廢棄物、礦物、纖維素及糖類資源培養(yǎng)的微生物菌體蛋白。具體有：飼料酵母、石油蛋白、菌體蛋白飼料、食用

25、菌菌絲體、白地霉，以及微型藻、光合細(xì)菌飼料等。微生物發(fā)酵飼料和菌體蛋白飼料這兩類不可截然分開，發(fā)酵飼料中也包含著營養(yǎng)豐富的菌體蛋白，而菌體蛋白的粗制品尤其是同態(tài)法生產(chǎn)的菌體蛋白飼料，亦包含有菌體之外的其他成分引。固態(tài)發(fā)酵菌種的選擇菌種是發(fā)酵必不可少的物質(zhì)，菌種篩選直接決定了發(fā)酵的成敗和發(fā)酵效果的優(yōu)劣。菌種性能對發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、蛋白轉(zhuǎn)化利用率、發(fā)酵參數(shù)的控制等都起到?jīng)Q定性的作用。所選菌種必須符合以下條件：（）能充分分解、利用餅粕、糟渣類及動物下腳料等纖維和大分子蛋白，并能在其上較好生長，且安全、無毒副作用；（）生長、繁殖速度快，以求盡可能縮短發(fā)酵周期：（）菌種遺傳性能穩(wěn)定，能在較長時期保持優(yōu)良的

26、性能；（）對其它菌株不拮抗；（）對環(huán)境適應(yīng)性強。從現(xiàn)有的研究進(jìn)展看，利用微生物單一菌株或組合菌株發(fā)酵，實現(xiàn)高蛋白菌體飼料的生物轉(zhuǎn)化，已經(jīng)取得了一定的研究成果。微生物蛋白飼料的生產(chǎn)菌種具有種類多和采用多菌種組合發(fā)酵的特點。其優(yōu)勢在于多個菌種之間可互相補償其缺陷，進(jìn)行協(xié)同互生發(fā)酵。大量的事實表明，微生物發(fā)酵法是加工各種原料最為經(jīng)濟(jì)、最為有效的方法，所以微生物在新飼料資源開河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩七論文發(fā)中的地位是非常重要的。在年時，美國就批準(zhǔn)了種被認(rèn)為是安全、有效的微生物“，我國農(nóng)業(yè)部在年月公布了嗜酸乳桿菌、啤酒酵母等種可作為飼用的微生物，此外還有研究和應(yīng)用新菌種的報道，如臘樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌

27、8;圳和同氮菌等。根據(jù)各種有關(guān)的資料報道，以下菌種經(jīng)常被選為發(fā)酵劑菌種舊地引。（）芽孢桿菌：芽孢桿菌是一種普遍存在的好氣性細(xì)菌，其生命過程中能以孢子體形式存在，易于生產(chǎn)和保存，為發(fā)酵程中常用菌種，這類菌可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和降解植物性飼料中的非淀粉多糖酶等。這些酶都具有較強的水解酶活性，可促進(jìn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。芽孢桿菌還可產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)，來抑制病原菌。由于芽孢桿菌中具有不易致死的芽孢，故飼喂時以活菌狀態(tài)進(jìn)入動物的消化系統(tǒng)，可抑制腸道中有害菌的生長繁殖，而且在生產(chǎn)加工特別是干燥過程中不易死亡，有利于產(chǎn)品的運輸和保藏。目前飼用微生物生產(chǎn)中應(yīng)用的主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌

28、、臘樣芽孢桿菌和需氧芽孢桿菌等。（）酵母菌：酵母菌一般為單細(xì)胞的子囊菌，其繁殖方式有無性繁殖和有性繁殖的不同。無性繁殖時，酵母菌有出芽生殖和分裂生殖兩種方式，其中出芽生殖是最普遍的繁殖方式。酵母菌具有特有的色、香、味，作為發(fā)酵劑的菌種來發(fā)酵蛋白飼料后使其適口性好，而且發(fā)酵過程中耐酸能力強，適宜于低值培養(yǎng)，并且不容易污染，回收率高。酵母菌可分泌多種活性水解酶，菌體蛋白含量高，可達(dá)，而且富含族類維生素，并能產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞分裂的生物活性物質(zhì)，有強化營養(yǎng)和抗病促長的效果。適于發(fā)酵蛋白飼料的酵母菌主要有啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母等。（）霉菌：絲狀真菌統(tǒng)稱為霉菌。霉菌真菌可以分泌豐富的酶類，例如淀

29、粉酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶等，這些酶類能夠促使原料中的高分子化合物淀粉、纖維素等分解為單糖，來供給微生物生長的需要，且霉菌中菌體蛋白質(zhì)的含量可達(dá)。因此，在蛋白飼料的生產(chǎn)中霉菌被廣泛使用。主要被應(yīng)用到飼料生產(chǎn)的霉菌有黑曲霉、白地霉、綠色木霉、康氏木霉、毛霉和黃曲霉等。（）乳酸菌：乳酸菌是寄生在動物胃腸道內(nèi)常的有益菌群，其可產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、酶類和乳酸菌素等多種物質(zhì)。乳酸菌分泌的有機(jī)酸包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等，這些酸類物質(zhì)本身既是營養(yǎng)物質(zhì)，又可降低腸道值，對病原菌和腐敗菌有抑制作用。乳酸菌分泌的過氧化氫和乳酸菌素對病原菌也有抑制和殺滅作用，從而減少了內(nèi)毒素等有害物質(zhì)的含量，使有益微生物

30、在競爭中占優(yōu)勢，從而非常有利于動物的生長發(fā)育，因此乳酸菌被廣泛用作微生物添和飼料發(fā)酵劑。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展固態(tài)發(fā)酵的含義和特點固態(tài)發(fā)酵又稱固體發(fā)酵，狹義上講固態(tài)發(fā)酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做同體支持物，其體系無水或接近于無水的任何發(fā)酵過程：廣義上講固態(tài)發(fā)酵是指一類使用不溶性同體基質(zhì)來培養(yǎng)微生物的工藝過程，既包括將固態(tài)懸浮在液體中的深層發(fā)酵，也包括河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩十論文在沒有（或幾乎沒有）游離水的濕同體材料上培養(yǎng)微生物的丁藝過程（等，）。多數(shù)情況下是指在沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性同態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物發(fā)酵的一個生物反應(yīng)過程。與其他培養(yǎng)方式相比，

31、固態(tài)發(fā)酵具有如下優(yōu)點：（）培養(yǎng)基簡單且來源廣泛，多為便宜的天然基質(zhì)或工業(yè)生產(chǎn)的下腳料；（）投資少，能耗低，技術(shù)較簡單；（）產(chǎn)物的產(chǎn)率較高；（）基質(zhì)含水量低，可大大減少生物反應(yīng)器的體積，不需要廢水處理，環(huán)境污染較少，后處理加工方便；（）發(fā)酵過程一般不需要嚴(yán)格的無菌操作。由丁【司態(tài)發(fā)酵廠“泛應(yīng)用于同態(tài)廢棄物的處理，可生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白、抗生素、酶制劑、有機(jī)酸、食品添加劑、生物飼料和生物農(nóng)藥，是一種解決能源危機(jī)、治理環(huán)境污染、解決人畜爭糧問題的有效途徑，是綠色生產(chǎn)的主要工具。因此，世紀(jì)年代以來，隨著世界性的能源危機(jī)的出現(xiàn)和環(huán)保意識的增強，固態(tài)發(fā)酵受到人們的普遍重視。固態(tài)發(fā)酵工藝的一般流程同體發(fā)酵生產(chǎn)的主

32、要工藝過程大致有以下五個部分：菌種擴(kuò)大培養(yǎng)、原料預(yù)處理、接種發(fā)酵、干燥、成品包裝。具體過程如下：斜面菌種活化培養(yǎng)一擴(kuò)大培養(yǎng)一菌種待發(fā)酵原料一滅菌處理一調(diào)制一接種混合一發(fā)酵一千燥一成品從上述過程來看，同態(tài)發(fā)酵部分主要包括培養(yǎng)基的預(yù)處理、混配料、調(diào)制滅菌、接種以及固態(tài)發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵等工序陋。固態(tài)發(fā)酵過程的控制參數(shù)分析固態(tài)發(fā)酵過程會涉及很多不同的參數(shù)，各參數(shù)對整個發(fā)酵都有不同程度的影響。經(jīng)分析，整個過程中對發(fā)酵影響較大的參數(shù)有：物料成分、溫度、物料含水量、氧氣含量、發(fā)酵周期、值等。（）物料成分：固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料所用基料大多是含有動物下腳料、渣粕類、淀粉或糖的農(nóng)副產(chǎn)品和工業(yè)廢渣等。微生物要在其上進(jìn)行

33、生長并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，必然會受到反應(yīng)物料本身的物理岡素（幾何形態(tài)、表面積大小、顆粒大小、顆粒含有孔隙體積的大小等）、化學(xué)因素（聚合度、結(jié)晶度、親、疏水性等和化學(xué)性質(zhì)等）和額外添加的無機(jī)氮及微量元素等的影響。目前研究較多的是物料顆粒大小、其孔隙大小、無機(jī)氮、微量元素等對固態(tài)發(fā)酵的影響。物料顆粒大小直接影響到單位體積顆粒所能提供的反應(yīng)表面積的大小，也會影響到菌體是否容易進(jìn)入基質(zhì)顆粒的內(nèi)部及氧的供給速率和代謝產(chǎn)物的移出速率等。在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白原料中，一股選用麩皮作為輔料（麩皮主要是作為一種膨松劑，同時也可作為輔助氮源）和些碳水化合物（如玉米粉），來增進(jìn)菌株的生長；培養(yǎng)基中可加入少量無機(jī)營養(yǎng)鹽，提供磷

34、、鉀、硫等，使微生物快速生長從而分泌適當(dāng)?shù)拿阜纸獾孜铽@得養(yǎng)分。氮源通常添加尿素、硫酸銨、等進(jìn)行蛋白氮的轉(zhuǎn)化，但有研究發(fā)現(xiàn)，尿素的加入可使發(fā)酵培養(yǎng)基的值升高，這不利于菌體的繁殖和代謝，且在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基中氮源的加入量也不宜過高，這是由于尿素和硫酸銨河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文等為非蛋白氮，分子量較小，溶液滲透壓較高，當(dāng)其超過一定濃度時對菌體的生長和增殖不利。無機(jī)鹽的加入量也不是越多越好，加入的濃度過低，菌種生長緩慢；加入的濃度過高，又抑制菌體生長。具體適合的碳源和氮源及它們的適宜比例要根據(jù)相麻菌株進(jìn)行優(yōu)化試驗舊刖。（）溫度：發(fā)酵溫度是發(fā)酵過程中影響有機(jī)生長繁殖最重要的岡素之一，任何生物化學(xué)的酶的反應(yīng)

35、都是直接與溫度變化有關(guān)。在司態(tài)發(fā)酵過程中，微生物需要適宜的生長溫度（真菌生長的最適溫度為）。發(fā)酵過程中伴隨微生物生長，會產(chǎn)生大量的反應(yīng)熱，但又因為固態(tài)發(fā)酵傳熱率差，易導(dǎo)致床溫急劇上升訓(xùn)（真菌致死溫度在），如果產(chǎn)生的熱不能及時散去，溫度就會影響菌株生長和產(chǎn)物的產(chǎn)率。此外，在同態(tài)發(fā)酵的過程中還要注意溫度梯度，傳熱困難使發(fā)酵體系很難維持在最佳溫度，在微生物生長對數(shù)周期內(nèi)，同體物料層溫度可超。較普遍的控溫方法是把通氣、溫度、濕度控制相結(jié)合，通過通風(fēng)冷卻和恒溫循環(huán)冷卻水系統(tǒng)控制同態(tài)發(fā)酵溫度并且控制好發(fā)酵時間。（）物料含水量：同態(tài)發(fā)酵最大特點就是無游離水。水是發(fā)酵的主要媒質(zhì)，會直接影響劍微生物生長狀態(tài)、營

36、養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散及利用、氧和二氧化碳的交換等，介質(zhì)含水量大小隨菌種及原料而異（等，）¨。物料含水量過高，會影響透氣性，使發(fā)酵物料內(nèi)部散熱難，易造成雜菌污染；而含水量低，造成物料膨脹程度低，微生物生長受抑制。后期由于水分的蒸發(fā)、微生物生長代謝活動和通風(fēng)等因素的影響，而造成物料較干，微生物難以生長，產(chǎn)量降低。一般情況下，同態(tài)發(fā)酵時底物起始含水量在左右（等，）口引。發(fā)酵起始階段，發(fā)酵底物的含水量可以適當(dāng)高一些。因為隨著發(fā)酵的進(jìn)行，水分不斷蒸發(fā)，底物含水量會不斷下降。（）氧氣含量：固態(tài)發(fā)酵利用的微生物兒乎都是好氧性的，氧氣的供應(yīng)是發(fā)酵能否成功的重要限制參數(shù)之一。通風(fēng)可以增加氧的傳遞，還有利于熱交

37、換。翻動或攪拌雖可防卜物料結(jié)塊，且利于熱交換，但過分的翻動或攪拌會影響菌體與基質(zhì)的接觸，并可能損傷菌絲體，使水分蒸發(fā)過多而使物料變干，抑制菌體生長。在實驗室及工業(yè)化大生產(chǎn)中，一般利用強制通無菌空氣來達(dá)到通風(fēng)的目的。但是通風(fēng)的速率由以下因素決定：微生物的特性、合成產(chǎn)物對氧的需求程度、發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)生的熱量多少、底物的料層厚度、微生物產(chǎn)生二氧化碳和其它易揮發(fā)代謝產(chǎn)物的量、底物間的空隙大小等引。通風(fēng)率增加，底物的含水量降低，導(dǎo)致底物干燥，相應(yīng)的空氣加濕的時間變長?？梢杂脷庀嗌V或氧分析儀來分析氧的濃度，根據(jù)情況及時調(diào)節(jié)強制通風(fēng)的速率。（）發(fā)酵周期：發(fā)酵周期是指發(fā)酵從開始到結(jié)束的時間，發(fā)酵終點的判斷對提高

38、產(chǎn)物的生產(chǎn)量有非常重要的意義。在發(fā)酵過程中，產(chǎn)物的濃度不是一成不變的，一般情況下，產(chǎn)物高峰生成階段的時間越長，整個發(fā)酵生產(chǎn)率也就越高，但到一定發(fā)酵時間后，產(chǎn)物產(chǎn)率提高減緩，甚至下降。因此，無論是獲得菌體還是代謝產(chǎn)物，微生物發(fā)酵都有其最佳時間階段。時間過短，不足以獲得所需的產(chǎn)量；時間過長，由于環(huán)境已不利于菌體生長，往往造成菌體自溶，產(chǎn)量下降，同時增加生產(chǎn)成本。所以適宜的發(fā)酵時間一定要考慮具體的菌種、工藝條件和產(chǎn)物，通過試驗來確定。河南農(nóng)業(yè)人學(xué)碩十論文（）值：值的變化與發(fā)酵的關(guān)系極為密切，對菌體的生長繁殖和產(chǎn)物積累的影響極大，但是在吲態(tài)發(fā)酵過程中很難有效控制。目前研究同態(tài)發(fā)酵過程中值變化，尤其是值

39、調(diào)控方面的研究比較少，通常采用具有緩沖性能的底物以減少對值控制的需要。另一個比較新穎的方法是以含氮無機(jī)鹽（如脲）做氮源，以抵消發(fā)酵過程中酸的生成帶來的負(fù)面影響。微生物發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的研究進(jìn)展微生物發(fā)酵蛋白飼料的來源相當(dāng)豐富，有工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的廢水渣如酒糟、醬油渣、淀粉渣、糖蜜等，纖維素類物質(zhì)如木薯、玉米稈、豇豆藤、米糠、木屑等，菜籽、棉籽餅粕、桐餅、芝麻餅等蛋白質(zhì)的下腳料，屠宰廠廢棄的毛、血、骨、皮等，雞、豬等畜禽糞便，魚蝦等海產(chǎn)品深加工產(chǎn)生的廢棄物。利用有益微生物同態(tài)發(fā)酵的技術(shù)，對動植物蛋白原料進(jìn)行發(fā)酵可以明顯改變飼料原料的理化性狀，減少抗?fàn)I養(yǎng)因子明顯并降低原料的毒性，改善其適口性，提高蛋

40、白質(zhì)含量，使氨基酸含量趨于平衡，維生素豐富，含有一些有益菌及未知生長因子等，營養(yǎng)價值大大提高等等。植物性蛋白飼料的研究進(jìn)展對發(fā)酵植物性蛋白原料的研究多集中在降低其抗?fàn)I養(yǎng)因子和提高含量兩方面。如中山大學(xué)生物系鐘英長等忸引（）人從自然界霉變棉籽餅中，分離篩選出對棉酚有耐受能力的霉菌，接種在棉籽中發(fā)酵，脫毒效率達(dá)一，總脫毒率在以上，并使棉籽餅的粗蛋白含量提高了。并在此基礎(chǔ)上研制了微生物固態(tài)菌種發(fā)酵脫毒法，該法具有脫毒率高、發(fā)酵時間短、投資小、成本低、工藝簡單、發(fā)酵過程能增加生物活性物質(zhì)、改善營養(yǎng)及適口性等特點。浙江大學(xué)顧賽紅等啪（）用黑曲霉對棉籽柏進(jìn)行固體發(fā)酵，使棉籽粕的粗蛋白提高了，必需氨基酸除精

41、氨酸外均增加，尤其是賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸分別提高了、和；發(fā)酵后棉籽粕的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和氨基酸等養(yǎng)分體外消化率也明顯提高，其中粗蛋白、賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸的體外消化率分別提高了“、和。董緒燕等（）采用枯草芽孢桿菌對菜籽餅粕進(jìn)行發(fā)酵，在最佳發(fā)酵條件下，菜籽餅粕中硫甙、異硫氰酸酯和惡唑烷硫酮得到完全降解，產(chǎn)生較高的溶栓酶，有利于提高油菜餅粕的附加值，為大量菜籽并判斷綜合利用開辟一條嶄新的途徑。鐘世榮等（）利用曲霉菌，采用菜籽餅粕與醬油渣混合發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，異硫氰酸酯和惡唑烷硫酮的總脫毒率可達(dá)，提高，粗纖維下降，適口性改善。等¨鍆（）利用少孢根霉固態(tài)發(fā)酵菜籽粕，降低了，粗蛋白含量增加。王冬梅等（）利用技術(shù)固體發(fā)酵啤酒糟生產(chǎn)蛋白飼料，發(fā)酵后產(chǎn)品提高，總提高，粗纖維含量降低。王曉杰等¨（）用好食脈孢霉對玉米酒糟進(jìn)行同態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)新型