心肌梗塞與細(xì)胞凋亡關(guān)系的初步探索

1、    心肌梗塞與細(xì)胞凋亡關(guān)系的初步探索        摘要探索人類心肌梗塞時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的證據(jù)。選用TUNEL的方法對(duì)22例急慢性心肌梗塞的心肌標(biāo)本及14例無心血管疾病的心肌標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因Bcl-2和Bax進(jìn)行檢測(cè)。急性梗塞區(qū)及梗塞周邊區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增多，以周邊區(qū)域最為明顯(P0.001);陳舊梗塞區(qū)仍能見到凋亡細(xì)胞，較急性區(qū)域明顯減少(P0.001)；在梗塞組正常區(qū)域及對(duì)照組偶見有凋亡細(xì)胞，2組間無顯著差異。在人類心肌梗塞的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

2、中發(fā)現(xiàn)有大量的凋亡細(xì)胞，為認(rèn)識(shí)心血管疾病展示了新的視野。關(guān)鍵詞心肌梗塞細(xì)胞凋亡Bcl-2Bax 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是一種與壞死截然不同的死亡方式，這是一種經(jīng)基因精密調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡(Programmed cell death)1。以往的研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡不發(fā)生在終末分化的心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中。直到90年代初，由于凋亡的分子生物學(xué)方面的進(jìn)展及實(shí)驗(yàn)手段的提高，人們?cè)诙喾N心血管疾病及正常老年心臟中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的證據(jù)2，3，并開展了心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的研究，但目前國內(nèi)在此方面的報(bào)道較少。為此，我們將我院1986年至1997年36例尸檢標(biāo)本進(jìn)行回顧性研究，以探索人類心肌梗塞與心肌細(xì)

3、胞凋亡的關(guān)系，對(duì)人類最終控制心血管疾病提供理論依據(jù)和防治措施。材料和方法1.資料來源36例心肌標(biāo)本取自同仁醫(yī)院1986年至1997年尸檢標(biāo)本。急性心肌梗塞病人22例，其中10例伴有陳舊心梗。臨床上均有急慢性心肌梗塞病史，組織學(xué)有急慢性心肌梗塞的病理改變。對(duì)照組14例是臨床無心血管疾病依據(jù)，(死于消化道出血，車禍，中毒性肺炎等)，病理無心肌缺血表現(xiàn)的心肌標(biāo)本。2.方法凋亡細(xì)胞檢測(cè)選用末端標(biāo)記TUNEL法，TUNEL試劑盒購自美國Boehringer Mannheim公司，具體按照試劑盒內(nèi)說明書操作，以Tris-HCL緩沖液替代生物素標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶的切片同時(shí)染色作為陰性對(duì)照。Bcl-2和Bax檢測(cè)

4、應(yīng)用生物素-鏈酶親和標(biāo)記蛋白顯色法，Bax兔IgG多抗，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體，生物素化山羊抗兔(IgF-Bio)二抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(S-A/HRP)等試劑購自美國Zymed公司。具體操作如下：切片脫蠟至水，3% H2O2浸泡15min，滴加5%的正常大鼠血清封閉10min，吸干血清，滴加一抗，4過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素孵育60min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以Tris-HCL緩沖液替代一抗的切片同時(shí)染色作為陰性對(duì)照。所有標(biāo)本同時(shí)切片行常規(guī)HE染色。3.評(píng)定方法TUNEL染色，陽性細(xì)胞核為棕黃色；Bcl-2和Bax染色，陽性細(xì)胞漿為棕黃色。選取相應(yīng)部位，細(xì)胞計(jì)數(shù)在200

5、倍高倍視野下，用標(biāo)準(zhǔn)的10×10目鏡欄珊計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)10個(gè)視野；結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的平均百分比表示。4.統(tǒng)計(jì)分析本研究所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果1. HE染色(1)急性梗塞區(qū)域早期損傷的心肌仍保存細(xì)胞輪廓，細(xì)胞核固縮，肌漿凝聚；胞漿嗜酸性增強(qiáng)，橫紋不清或消失收縮帶形成；進(jìn)一步發(fā)生凝固性壞死。凝固性壞死的心肌細(xì)胞位于梗塞中心區(qū)，梗塞間質(zhì)有出血和炎性細(xì)胞浸潤(1)。(2)陳舊梗塞區(qū)心肌纖維消失代之以瘢痕組織形成(2)。(3)對(duì)照組觀察左心室，均為正常的組織學(xué)形態(tài)，無出血壞死和炎癥表現(xiàn)。所有標(biāo)本未見有典型凋

6、亡小體。1急性心梗組織胞漿嗜酸性增強(qiáng)，可見凝固性壞死及炎性細(xì)胞浸潤HE×1002陳舊心梗組織可見局部瘢痕形成HE×1002.TUNEL染色(1)與HE相對(duì)應(yīng)的急性梗塞區(qū)梗塞周邊區(qū)均有較多細(xì)胞核呈棕色凋亡細(xì)胞，較對(duì)照組明顯增多(P0.001)，以周邊部增多最為顯著，與梗塞中心區(qū)相比P0.001。(2)陳舊梗塞區(qū)可見有散在的凋亡細(xì)胞，較急性區(qū)域明顯減少(P0.001)。(3)遠(yuǎn)離梗塞區(qū)及對(duì)照組的心肌組織中極偶見凋亡細(xì)胞。對(duì)照組的凋亡細(xì)胞數(shù)量與遠(yuǎn)離梗塞灶的正常區(qū)域的心肌組織無差異(P=0.698)見37，表1。表1凋亡細(xì)胞在心梗各區(qū)域及對(duì)照組中的分布急性梗塞區(qū)A急性周邊區(qū)B陳舊梗

7、塞區(qū)C梗塞組正常區(qū)D對(duì)照組E均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)誤19.377.941.6936.2714.443.084.721.820.673.521.990.423.222.150.833急性心梗組織可見較多凋亡細(xì)胞 TUNEL染色×2004陳舊心梗組織凋亡細(xì)胞散在分布 TUNEL染色×2005Bcl-2陽性細(xì)胞呈散在分布 Bcl-2染色×1006Bax陽性細(xì)胞呈散在分布 Bax染色×1007凋亡細(xì)胞在各組分布3.Bcl-2和Bax染色(1)急性梗塞區(qū)及周邊區(qū)域Bcl-2表達(dá)增加(20/22)；Bax的表達(dá)亦增加(21/22)(5)。(2)陳舊梗塞區(qū)域Bcl-2偶見(1

8、/10)，而瘢痕區(qū)未見Bcl-2的表達(dá)；陳舊梗塞區(qū)域仍可見Bax有較多表達(dá)(6)。(3)正常對(duì)照組及梗塞組正常區(qū)域極偶見Bcl-2的表達(dá)；Bax的表達(dá)較前2組減少。表2Bcl-2和Bax在心梗各組及對(duì)照組中的分布急性梗塞區(qū)陳舊梗塞區(qū)梗塞組正常區(qū)對(duì)照組Bcl-2表達(dá)Bax表達(dá)91.1%(20/22)95.4%(21/22)20.0%(2/10)33.3%(3/10)9.1%(2/22)13.6%(3/22)7.0%(1/14)21.1%(3/14)討論程序化細(xì)胞死亡-細(xì)胞凋亡存在于各組織細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞的正常分化，成熟和發(fā)育具有重要的平衡意義。然而，細(xì)胞凋亡異常又會(huì)帶來嚴(yán)重危害。在終末期分化的心肌

9、細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的研究起步較晚。1993年，人們?cè)贏RVD(先天右室發(fā)育不良)的病人心肌上發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的證據(jù)4，它提示在人類心臟上亦存在有細(xì)胞凋亡。Saraste等5用TUNEL和瓊脂糖免疫凝膠電泳的方法對(duì)8例死于急性心肌梗塞的病人心肌標(biāo)本進(jìn)行研究，其中6例是生前接受了成功溶栓的組織標(biāo)本，結(jié)果顯示各標(biāo)本均可見到典型的凋亡生化特征。心肌細(xì)胞凋亡在心肌梗塞的周邊部(border zones)最為明顯。本實(shí)驗(yàn)與Saraste等結(jié)果相一致，在急性心梗時(shí)，在急性梗塞中心部及其周邊部可檢測(cè)到較多凋亡細(xì)胞，以梗塞周邊部最為顯著，在陳舊梗塞區(qū)域仍能見到凋亡細(xì)胞。推測(cè)在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血損傷時(shí)首先啟動(dòng)了凋亡機(jī)制

10、，隨著損傷加重和時(shí)間的延長，缺血中心區(qū)域便出現(xiàn)壞死，而梗塞周邊的心肌細(xì)胞處于可逆的損傷狀態(tài)，在這一區(qū)域的細(xì)胞死亡仍以凋亡為主。一些實(shí)驗(yàn)顯示心室壁重構(gòu)現(xiàn)象，存活的心肌細(xì)胞肥大及毛細(xì)血管增生減少在鄰近梗塞區(qū)域更為明顯6，提示心肌細(xì)胞凋亡使心梗后結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)受到限制。周邊部心肌細(xì)胞凋亡使梗塞周圍的心肌細(xì)胞繼續(xù)死亡?？梢娦募〖?xì)胞凋亡在心梗預(yù)后中起著重要的作用。另外，在陳舊梗塞區(qū)域見到細(xì)胞凋亡，證實(shí)細(xì)胞凋亡可長期存在于梗塞周邊部，在較長時(shí)間內(nèi)可因細(xì)胞凋亡使心肌細(xì)胞丟失。本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有凋亡小體，可能存在下列原因：1.細(xì)胞凋亡后凋亡小體迅速被巨噬細(xì)胞吞噬，這種過程較短暫，不易被觀察到。2.由于鄰近壞死

11、細(xì)胞激活了炎性細(xì)胞而改變了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。炎性細(xì)胞的浸潤和激活可能使凋亡轉(zhuǎn)化為壞死，即凋亡和壞死可能有共同途徑。3.可能在心肌細(xì)胞中只要部分凋亡途徑被激活。染色質(zhì)固縮和DNA片段化可在心肌組織中觀察到7，而形成凋亡小體的必要因素在心肌組織中缺失。但要發(fā)現(xiàn)凋亡小體缺失的確切原因，需進(jìn)行系統(tǒng)細(xì)致的研究。原癌基因Bcl-2是目前公認(rèn)的促進(jìn)細(xì)胞生存抑制細(xì)胞凋亡的長壽基因8。正常情況下，Bcl-2在心肌中不表達(dá)，Bax僅有弱表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中在急性梗塞區(qū)域可見有Bcl-2表達(dá)增加，而陳舊梗塞區(qū)僅有弱表達(dá)。推測(cè)Bcl-2的表達(dá)挽救了心梗早期階段的存活細(xì)胞。在心肌細(xì)胞受到缺血損傷時(shí)，Bcl-2立即啟動(dòng)，其基因

12、產(chǎn)物的表達(dá)可抑制或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，與此同時(shí)Bax與Bcl-2平行增高，Bcl-2和Bax的相互作用決定了細(xì)胞是否繼續(xù)存活9。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不十分清楚，可能與抗氧化途徑，阻止細(xì)胞內(nèi)鈣重新分布，直接或間接影響其他死亡信號(hào)對(duì)細(xì)胞的作用，以及加速DNA的修復(fù)來起作用。Bax是與Bcl-2同處一家族的成員之一，可通過與Bcl-2形成異源二聚體，從而抑制了Bcl-2的作用。目前心血管疾病已成為威脅人類生命的重要病因，心肌梗塞的發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)。在人類急性心肌梗塞中細(xì)胞凋亡及其標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)拓展了心肌梗塞的發(fā)病機(jī)理。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，是有動(dòng)態(tài)發(fā)展的特點(diǎn)，如能尋求控制心肌細(xì)胞凋亡的

13、機(jī)制，對(duì)心臟病患者的診斷及治療有重要意義。劉琦(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院干部醫(yī)療科100730)常志文(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院干部醫(yī)療科100730)參考文獻(xiàn)1，Kerr,JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239257.2，Richardo HB,Hailey LS,Xie SS,et al.In situ apoptosis assay for the

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