血管內(nèi)皮細胞抗?jié)h坦病毒的固有免疫

1、血管內(nèi)皮細胞抗?jié)h坦病毒的固有免疫    Answer a fool according to his folly.                   作者：王平忠, 王九平, 白雪帆, 賈戰(zhàn)生, 黃長形, 姜泓 【關(guān)鍵詞】  血管內(nèi)皮細胞; 漢坦病毒; 固有免疫漢坦病

2、毒（Hantavirus, HV）包括引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的漢灘病毒（Hantaan virus, HTNV）、漢城病毒（Seoul virus, SEOV）、普馬拉病毒（Puumala virus, PUUV）、多布拉伐病毒（Dobrava virus, DOBV）和引起漢坦病毒肺綜合征（hantavirus pulmonary syndrome,

3、 HPS）的辛諾柏病毒（Sin nombre virus, SNV）、 紐約病毒（New York virus, NYV）、 牛軛湖病毒（Bayou virus, BAYV）、安第斯病毒（Andes virus, ANDV）以及與人類關(guān)系尚不清楚的一組病毒, 如希望山病毒（Prospect Hill virus, PHV）、圖拉病毒（Tula virus, TULV）等。其中, HTNV和SEOV

4、分別是我國姬鼠型（型）和家鼠型（型）疫區(qū)HFRS的主要流行毒株, 嚴重危害我國人民的生命健康。研究表明, HV主要感染血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell, VEC）導致通透性增加, 血漿外滲, 但不引起直接的細胞病變, 提示HV誘導的免疫反應是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)及HV致病的主要環(huán)節(jié)。固有免疫（innate immunity）作為機體抗感染免疫的第一道防線, 主要在獲得性免疫(adaptive immunity)活化前, 發(fā)揮抗感染作用()。近年,&

5、#160;血管內(nèi)皮細胞抗HV固有免疫取得了重要進展。1  血管內(nèi)皮細胞的特點Children and fools cannot lie.      血管壁由內(nèi)向外分為內(nèi)膜、中層、外膜。內(nèi)膜主要為內(nèi)皮細胞, 中層以平滑肌細胞為主, 外膜則是一層較薄的結(jié)締組織。內(nèi)皮是人體最廣泛存在的組織細胞, 為多角形單層扁平上皮, 覆蓋于血管內(nèi)表面, 與其下層疏松結(jié)締組織構(gòu)成血管的內(nèi)膜層。細胞的內(nèi)側(cè)面與血液相鄰, 表面帶有負電荷, 以防止血細胞聚集。電鏡下可見內(nèi)皮細胞含有非

6、常發(fā)達的高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 它們是內(nèi)皮細胞具有合成和分泌功能的主要結(jié)構(gòu)基礎, 例如內(nèi)皮細胞可以合成和分泌內(nèi)皮素、血管緊張素、 內(nèi)皮源性舒張因子（如NO）、細胞因子和趨化因子（如IL1、IL6、 IL8、IP10、RANTES）等1, 參與血管張力和免疫調(diào)節(jié)。其次, 內(nèi)皮細胞胞質(zhì)富含質(zhì)膜小泡（吞飲小泡）, 這些小泡由細胞游離面或基底面的細胞膜內(nèi)凹形成, 然后與細胞膜脫離, 經(jīng)細胞質(zhì)移向?qū)?cè), 又與細胞膜融合, 將小泡內(nèi)的物質(zhì)釋出細胞外, 故小泡有向血管外輸送物質(zhì)

7、的作用(醫(yī)藥學/臨床醫(yī)學論文 )。此外, 內(nèi)皮細胞具有特征性的窗孔結(jié)構(gòu), 主要見于毛細血管的內(nèi)皮細胞, 它們是血管腔與內(nèi)皮間隙的細小通道, 對提高毛細血管內(nèi)皮通透性具有重要意義。因此, 血管內(nèi)皮細胞具有重要的生理和免疫功能。2  血管內(nèi)皮細胞抗HV固有免疫反應    HV主要感染血管內(nèi)皮細胞, 引起血小板減少、全身小血管和毛細血管廣泛損傷以及血管內(nèi)皮細胞腫脹變性等主要病理改變。近年來, 血管內(nèi)皮細胞抗HV固有免疫研究取得了重要進展。在HV感染的內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn):

8、0;HTNV或SNV感染HMVECLs（人肺微血管內(nèi)皮細胞）, 引起IRF3（干擾素調(diào)節(jié)因子3）和IRF7向細胞核移位, 誘導趨化因子RANTES和IP10表達2。RANTES和IP10是單核白細胞的主要趨化因子, 研究表明, IP10在抗病毒感染的Th1免疫應答形成中具有重要作用3。在HFRS和HPS, 也發(fā)現(xiàn)具有Th1免疫應答4。致病（HTNV、NYV1）和非致病漢坦病毒（PHV）感染的HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）, 在感染早期（第1天）即表現(xiàn)出基因轉(zhuǎn)錄誘導的差異（如PHV誘導47個基因轉(zhuǎn)錄, NYV1誘導2個基因轉(zhuǎn)錄

9、, HTNV僅誘導1個基因轉(zhuǎn)錄）。而感染晚期（第4天）轉(zhuǎn)錄應答類似, 可引起干擾素刺激基因（ISG）, 如OSA（寡腺甙酸合成酶）、MxA、IRF等的轉(zhuǎn)錄。但不同病毒能誘導細胞產(chǎn)生各自獨特的抗病毒效應分子, 只有HTNV能誘導IFN、IL8、IL6、GMCSF、GCSF、IL7R、 Cox2（環(huán)氧合酶）等的分泌5。這些細胞因子/趨化因子是中性粒細胞和淋巴細胞的強趨化劑, 它們可能改變血管的完整性, 從而導致發(fā)病?？赡苷菍V應答的這些細胞因子的差異, 在臨床和病理生理方面使HFRS不同于HPS。HTNV和TULV

10、感染的HUVEC均可表達MHC類分子。然而, 感染TULV后, 能更快地上調(diào)類分子表達。在這兩種病毒中, 只有HTNV能誘導產(chǎn)生高水平的IFN, 但都不能誘導IFN分泌。此外, 感染TULV后16h, 可誘導抗病毒MxA蛋白的表達, 而感染HTNV后48 h才有MxA表達6。MxA在內(nèi)皮細胞中的延遲誘導可能有利于病毒的復制和傳播。用活的或紫外滅活的SNV感染HUVEC后, 發(fā)現(xiàn)宿主干擾素誘導基因及其相關(guān)基因（如IRF、ISG、MxA、OSA等）, 在感染早期（第1天）具有類似的基因表達譜,

11、60;但對滅活SNV的應答超過對活SNV的應答; 而在感染晚期（第3天）則相反, 表明SNV誘導先天性免疫應答基因的表達, 不需要病毒復制7。滅活病毒被宿主識別的機制尚未完全闡明, 可能與宿主對病毒糖蛋白的識別和（或）通過宿主細胞受體如模式識別受體(pattern recognition receptors, PRR)的信號轉(zhuǎn)導有關(guān)8。上述研究表明, HV感染血管內(nèi)皮細胞后, 可誘導特異性基因表達, 分泌細胞因子/趨化因子, 產(chǎn)生抗病毒作用。3 血管內(nèi)皮細胞抗病毒固有免疫的分

12、子機制    內(nèi)皮細胞不僅是機體重要的屏障和半透膜, 而且具有重要的代謝和內(nèi)分泌功能。血管內(nèi)皮對環(huán)境及促炎癥活化信號的反應可影響和指導免疫應答, 導致細胞因子、 趨化因子和細胞黏附分子（CAM）的局部表達, 有助于循環(huán)的免疫細胞募集至損傷、炎癥或病毒感染的部位。病毒感染能以多種方式導致血管內(nèi)皮細胞的變化, 例如, 間接通過感染的或活化的淋巴細胞, 觸發(fā)促炎癥淋巴因子的合成和局部釋放, 或者在免疫介質(zhì)缺乏時直接誘導細胞因子、 趨化因子和CAM在內(nèi)皮細胞中的表達變化,&

13、#160;來誘導內(nèi)皮細胞活化。大多數(shù)病毒感染都能被宿主先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)清除。先天性免疫應答是防御入侵病原體的第一道防線, 其主要標志是型干擾素（IFN/）的合成和分泌。觸發(fā)有效抗病毒先天性免疫應答需兩個條件: 一是通過細胞模式識別受體（PRR）感受入侵的病毒, 二是調(diào)節(jié)干擾素合成的蛋白級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導通路的啟動。目前已發(fā)現(xiàn)兩類PRRs與固有免疫有密切關(guān)系, 即Toll樣受體（Tolllike receptor, TLR）和視黃酸誘導基因（retinoic acid inducible gene,&#

14、160;RIG）。這些受體位于細胞的不同部位, 識別不同的配體（病原體相關(guān)分子模式: pathogenassociated molecular patterns, PAMP）。在獲得性免疫形成前, PAMP誘導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導, 產(chǎn)生型干擾素（IFN/）等固有免疫反應, 以抵抗病毒的侵襲。    Toll樣受體（TLR）屬型跨膜蛋白, 由胞外區(qū)（550-980個氨基酸）、跨膜段和胞內(nèi)區(qū)（約130個氨基酸）3部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復序列（LRRs）, 能

15、識別病原體成分; 胞內(nèi)區(qū)有一個Toll/IL1R(TIR)區(qū)域, 是高度保守的蛋白質(zhì)相互作用區(qū), 通過與轉(zhuǎn)接分子的相互作用轉(zhuǎn)導信號。迄今, 已發(fā)現(xiàn)11種TLRs, 它們在細胞內(nèi)均有一定的分布。TLR1、2、4、5、6表達于細胞表面, TLR3、7、8、9存在于細胞的胞內(nèi)體（endosome）。體內(nèi)的大多數(shù)細胞至少表達一類TLR, 如血管內(nèi)皮細胞可高水平表達TLR49。TLRs對病原體成分的識別有明確的“分工”: TLR1/TLR2異二聚體識別三?；? TLR2/TLR6異二聚體識別二?；?

16、0;TLR4識別細菌脂多糖(LPS); TLR3感受雙鏈RNA分子（dsRNA）; TLR5識別鞭毛蟲的鞭毛蛋白（flagellin）; TLR7/8是單鏈RNA（ssRNA）的識別受體; TLR9的配體是含未甲基化CpG基序的細菌DNA; 最近鑒定的TLR11感受引起膀胱和腎臟感染的細菌10。因此, 不同的TLRs可識別不同的病原體結(jié)構(gòu)成分。對病毒而言, 已發(fā)現(xiàn)4種PAMPs: 雙鏈RNA（dRNA）、 CpG、單鏈RNA（ssRNA）和包膜糖蛋白。TLRs被PAMPs活化后, 導致特異性轉(zhuǎn)接

17、蛋白MyD88（髓樣分化因子88）募集至TLRs的胞內(nèi)區(qū), 與IL1受體相關(guān)激酶（IRAK）結(jié)合。然后, 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）被募集并與IRAK相互作用, 導致下游NFB誘導激酶（NIK）和IB激酶（IKK）活化。IKK介導NFB抑制劑（IB）的磷酸化, 隨之IB降解, 使NFB發(fā)生細胞核移位。大多數(shù)TLRs均通過這條途徑轉(zhuǎn)導信號（MyD88途徑）。然而, TLR3或TLR4與PAMPs相互作用, 招募另一轉(zhuǎn)接蛋白（Toll/IL1 receptor domaincontaining&

18、#160;adaptor inducing IFN, TRIF）, 使IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和（或）NFB活化（TRIF途徑）（圖1）。  上述兩條途徑的最終效應是導致特異性基因表達和細胞因子/趨化因子的分泌, 產(chǎn)生抗病毒固有免疫作用。Beg from beggers and you'll never be rich.      視黃酸誘導基因（RIG）是近年發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)病毒雙鏈RNA（dsRNA）（單鏈RNA復制的中間體）的受體11。它是DExD/H box&

19、#160;RNA解旋酶蛋白家族的一個成員。RIG解旋酶結(jié)構(gòu)域能結(jié)合合成的dsRNApoy(IC)和病毒dsRNA。除C端解旋酶結(jié)構(gòu)域外, N端還含有2個串聯(lián)的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARDs）。含2個CARDs的RIGN端的過度表達, 在缺乏病毒刺激時就足以活化NFB和IFR3, 而全長的RIG僅在dsRNA存在時被活化。因此, dsRNA結(jié)合至RIG的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域可能誘導N端CARDs結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化, 以募集下游信號轉(zhuǎn)導蛋白。RIG在抗病毒免疫中的作用首先被RNA干擾（RNAi）和小鼠基因敲除研究證實11, 12。L929細

20、胞系（一種小鼠成纖維細胞系）的RIGRNAi在對RNA病毒的應答中, 不僅抑制IRF3活化, 而且抑制后來的型IFN的誘導。RIG基因敲除小鼠的胚胎表現(xiàn)出嚴重的肝臟退化, 并且大多數(shù)都是胚胎致死的。RIG突變小鼠致死表型的機制尚不明確, 但在小鼠胚胎成纖維細胞和肺成纖維細胞中, 已表明RNA病毒對IFN和ISGs的誘導被終止。用IFN預處理RIG缺陷的成纖維細胞系可增加對水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）的抗性, 提示RIG是IFN誘導必需的, 且不

21、影響IFN下游信號轉(zhuǎn)導途徑。    最近, 4個研究小組獨立地鑒定了RIG下游的一個CARD結(jié)構(gòu)域13-16, 這個蛋白現(xiàn)在統(tǒng)一命名為線粒體抗病毒信號轉(zhuǎn)導蛋白（mitochondrial antiviral singaling protein, MAVS）。MAVS在抗病毒信號轉(zhuǎn)導中具有重要作用: MAVS的過度表達導致IRF3和NFB的活化, 從而產(chǎn)生型IFN; MAVS的表達被RNAi沉默后, 可以廢除由病毒和RIG過度表達引起的IFN誘導; 

22、;在MAVS表達缺乏時, 與IRF3、 NFB活化有關(guān)的激酶不能被激活; MAVS的過度表達可防止VSV引起的細胞病變, 而MAVS的RNAi使細胞對病毒更易感。MAVS具有上述作用的原因是它是連接RIG與IKK和TBK1的一個重要的轉(zhuǎn)接分子。但MAVS如何被RIG調(diào)節(jié)？它又如何活化下游激酶？線粒體在活化IKK和TBK1中有何作用？這些問題目前仍不清楚。但MAVS在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）研究領(lǐng)域獲得了重要突破。Li等17研究表明, HCV NS3/4A能結(jié)合并與MAV

23、S在線粒體膜上共定位, 體外NS3/4A可直接切割MAVS, 而MAVS的Cys508突變, 能防止對它的切割, 并恢復IFN誘導。Meylan等16的研究也表明, 轉(zhuǎn)染的MAVS在HCV感染的肝細胞中被切割。因此, HCV NS3/4A對MAVS進行切割, 與線粒體分離, 麻痹宿主的免疫系統(tǒng), 這可能是HCV持續(xù)感染的原因之一。    HV是有包膜的單股負鏈RNA病毒, 基因組包括L、M、S3個片段, 分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶

24、、包膜糖蛋白（G1, G2）和核蛋白（NP）。HV感染引起的內(nèi)皮細胞信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)和細胞防御應答的報道很少。HV有3種細胞質(zhì)蛋白, 即多聚酶、 核蛋白和G1細胞質(zhì)尾（142個氨基酸殘基）, 它們有調(diào)節(jié)先天性免疫應答的能力。Alff等18研究發(fā)現(xiàn), 致?。∟Y1V、HTNV）和非致?。≒HV）HV感染血管內(nèi)皮細胞后1d, IFN特異性轉(zhuǎn)錄應答存在明顯差異。進一步研究證實, NY1V G1細胞質(zhì)尾的表達可抑制RIG和TBK1（TANK結(jié)合激酶1）引導的IFN應答, 但不能抑制IRF3引導的IFN轉(zhuǎn)錄, 

25、;表明G1尾在TBK1復合體水平, IRF3磷酸化的上游調(diào)節(jié)細胞IFN應答。TBK1是RIG和TLR4信號轉(zhuǎn)導途徑中一個重要的激酶, 活化的TBK1引導IRF3磷酸化和NFB活化, 使其發(fā)生細胞核移位, 誘導型IFN的分泌19。RIG和TLR是不重復的2條途徑, 在不同細胞介導抗病毒信號轉(zhuǎn)導。然而, HV感染誘導先天性免疫應答是通過RIG還是TLR傳遞信號, 目前尚不清楚。4  結(jié)語    VEC不僅是機體內(nèi)重要的屏障和半透膜, 而且具有重要的代謝和內(nèi)分泌

26、功能。HV主要感染VEC, 引起血小板減少、 全身小血管和毛細血管廣泛損傷以及VEC腫脹變性等主要病理改變, 導致HFRS患者血管通透性增加, 血漿滲漏。諸多研究表明, 上述變化與HV誘導的免疫反應有密切關(guān)系。PRR是聯(lián)系固有免疫與適應性免疫的橋梁, 近年VEC抗HV固有免疫雖已取得了重要進展, 但HV識別的PRR及其信號轉(zhuǎn)導途徑尚不清楚。因此, 以VEC為靶細胞深入研究抗HV免疫反應, 對闡明HV感染致病的分子機制, 研制新型疫苗和治療藥物具有重要的意義。【參考文獻】  1

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