不結(jié)球白菜BcHSP81-4基因在Po1CMS中的表達(dá)分析及BcFLC基因的功能驗(yàn)證

1、不結(jié)球白菜BcHSP81-4基因在 Po1CMS中的表達(dá)分析及BcFLC基因的功能驗(yàn)證細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是作物雜交育種的重要材料, 也是研究花粉發(fā)育、細(xì)胞質(zhì)遺傳、核質(zhì)互作以及時(shí)序性表達(dá)的理想材料。因此, 對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子機(jī)理的研究具有非常重要的意義。不結(jié)球白菜 (Brassicacampestrisssp. chienesisMakino) 原產(chǎn)于中國(guó) , 是我國(guó)南方普遍種植的大眾化蔬菜, 在蔬菜周年供應(yīng)中起著舉足輕重的作用。近年來(lái) , 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 對(duì) CMS的研究取得了較大的進(jìn)展, 但雄性不育的機(jī)理研究尚不清楚。 故本研究以 Pol 胞質(zhì)雄性不育系及其保持系為材料,從分子生

2、物學(xué)方面入手 , 對(duì)不結(jié)球白菜 Pol 雄性不育系和保持系花期發(fā)育之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了研究分析, 有助于全面地了解高等植物中雄性不育發(fā)生的機(jī)理。同時(shí) , 不結(jié)球白菜先期抽薹現(xiàn)象降低了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量, 晚抽薹基因 FLC的引入可避免該現(xiàn)象 , 但 FLC對(duì)植物發(fā)育存在消極影響, 因而 , 對(duì)抽薹和植物發(fā)育關(guān)系的研究具有重要意義。本文主要研究結(jié)果如下： 1. 不結(jié)球白菜 Pol 胞質(zhì)不育系花期抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建以不結(jié)球白菜Pol 胞質(zhì)雄性不育系及其保持系為材料, 采用抑制性消減雜交 (supperssion subtraetive hybridization, SSH)技術(shù) , 構(gòu)建 Po

3、l 胞質(zhì)雄性不育系抑制消減 cDNA文庫(kù)。菌落 PCR檢測(cè)顯示 , 有效重組率為 91%,插入片段大小主要集中在 100bp 到 1000bp 之間。斑點(diǎn)雜交篩選得到32 個(gè)陽(yáng)性克隆 , 序列測(cè)定和同源性比對(duì)分析表明 ,15 個(gè)克隆功能未知 , 其余涉及到激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、第二信使、光合作用、脂肪酸代謝及衰老等多個(gè)方面。2. 不結(jié)球白菜 BcHSP81-4基因的克隆及其在PolCMS中的表達(dá)分析從不結(jié)球白菜 Pol 胞質(zhì)雄性不育系抑制消減cDNA文庫(kù)中篩選出一條BcHSP81-4基因 , 經(jīng)鑒定是熱激蛋白家族的成員之一。從BcHSP81-4基因的氨基酸比對(duì)中 , 發(fā)現(xiàn)其與其他物種的 HSP90家族

4、具有很高的同源性。同時(shí), 本文還研究了 BcHSP81-4在不同花發(fā)育時(shí)期和不同脅迫條件下的表達(dá)差異。結(jié)果表明 ,BcHSP81-4 在 35的熱脅迫條件下 , 表達(dá)無(wú)顯著差異 , 但是在鹽脅迫和冷脅迫條件下 , 都能誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)本文也發(fā)現(xiàn)BcHSP81-4基因在不育系的花蕾中高表達(dá) , 因此 , 本研究推測(cè) BcHSP81-4基因在 polCMS不育系中也可能起一定的作用。將 BcHSP81-4基因片段連接到原核表達(dá)載體PGEX-4T-3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)后誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳 , 產(chǎn)生了預(yù)期大小的重組蛋白 , 進(jìn)一步證明了該基因

5、屬于熱激蛋白 90 家族。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示該蛋白含 699 個(gè)氨基酸 ,分子量為 80.05KD, 理論等電點(diǎn) pI 值為 4.95 。TMpred 跨膜分析結(jié)果顯示 , 它含有1 個(gè)顯著的跨膜螺旋區(qū) , 這個(gè)區(qū)域與 ProtScale 預(yù)測(cè)的疏水區(qū)基本對(duì)應(yīng)。用 TargetP server和 WOLFPSORT server程序預(yù)測(cè)該蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白, 二級(jí)結(jié)構(gòu)以 a- 螺旋和隨機(jī)卷曲為主。 3. 不結(jié)球白菜晚抽薹基因BcFLC過(guò)表達(dá)影響擬南芥的育性和抗寒性FLC在擬南芥中對(duì)開(kāi)花是一個(gè)劑量依賴(lài)型抑制因子。本實(shí)驗(yàn)室從不結(jié)球白菜中克隆到一條FLC相關(guān)序列 , 命名為 BcFLC,本研究將該基

6、因在擬南芥中組成型過(guò)表達(dá) , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,BcFLC可以顯著延遲抽薹時(shí)間10 天左右 , 表明BcFLC是抑制抽薹開(kāi)花的一個(gè)基因。在 BcFLC過(guò)表達(dá)植株中 , 花期的 SOC1的表達(dá)量降低 , 但 LFY和 FT的表達(dá)量顯著高于對(duì)照。因此本文認(rèn)為 BcFLC過(guò)表達(dá)植株比對(duì)照植株需要更多劑量的 LFY和 FT 來(lái)促進(jìn)開(kāi)花。同時(shí) , 本文還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BcFLC的擬南芥育性受到影響 , 主要是由于 RGA和 RGL等花絲抑制因子的表達(dá)量上升和SEP3等花和胚珠發(fā)育相關(guān)基因的下調(diào)造成的。在 BcFLC過(guò)表達(dá)植株中 ,CBF1,2,3 和 COR15a等抗寒相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào) ,植株抗寒性增強(qiáng) , 表明 BcFLC的過(guò)表達(dá)激活了 CBF1,2,3 和 COR15a抗寒基因的表達(dá) , 從而提高植物的抗寒性。 4. 外源硝酸鹽和 NaCl 脅迫對(duì)擬南芥開(kāi)花的調(diào)節(jié)植物開(kāi)花受到內(nèi)源和外源信號(hào)的雙重調(diào)節(jié)。很多植物在一定的逆境脅迫下 ( 如低硝酸鹽和鹽脅迫 ) 都能提前開(kāi)花 , 但有關(guān)這些脅迫是如何調(diào)節(jié)植物開(kāi)花的機(jī)理尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的硝酸鹽和 NaCl 脅迫能夠增強(qiáng) GA生物合成酶 GA1的活性 ,激活 GA的生物合成。從而使得 CO和 SOC1的表達(dá)量增強(qiáng) , 促進(jìn)開(kāi)花。但是硝酸鹽和 NaCl 對(duì)開(kāi)花光周期途徑的影響是不同的。光周期相關(guān)基因 CCA1和 LHY在低濃度 NaCl 脅迫下