主管檢驗(yàn)技師考試臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)講義第七章放射免疫分析

1、資料收集丁網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除第七章放射免疫分析第一節(jié)放射免疫技術(shù)一、優(yōu)點(diǎn)靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡(jiǎn)便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析。二、基本類型及原理（_）放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體為基本原理而量的一種分析法。（二）免疫放射分析（IRM3是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待測(cè)抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)三、常用的放射性核素125i、131i、（三）標(biāo)記物的純化：1251標(biāo)記物反應(yīng)后，標(biāo)記物需進(jìn)行分離純化以去除游離125

2、1和其他雜質(zhì)。純化標(biāo)記物的方法有利用分子篩機(jī)制的凝膠過濾法、利用游離1251與標(biāo)記物分子極性差異進(jìn)行吸附解離的離子交換層析法、按分子所帶電荷和直徑不同在電場(chǎng)作用下分子遷移速率不同進(jìn)行分離純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE以及高效液相色譜法。（四）標(biāo)記物的鑒定放射化學(xué)純度：是指單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率，一般要求大于95%該項(xiàng)參數(shù)還是觀察在貯存期內(nèi)標(biāo)記物脫碘程度的重要指標(biāo)。免疫活性比放射性五、方法學(xué)評(píng)價(jià)為增強(qiáng)結(jié)果的可比性，需對(duì)RIA方法學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。除常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性等指標(biāo)外，還應(yīng)注意以下指標(biāo)：（一）可靠性：又稱健全性，是評(píng)價(jià)被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)品

3、的免疫活性是否相同的指標(biāo)。借助標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品稀釋曲線的平行性分析來判斷方法的可靠性。平行性好者可靠。（二）劑量-反應(yīng)曲線：標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)是通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)的反應(yīng)參數(shù)繪制成劑量-反應(yīng)曲線，待測(cè)物定量是通過計(jì)算其反應(yīng)參數(shù)在劑量-反應(yīng)曲線上對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值而確定。h、14c等，使用最廣泛的是125i。四、放射性標(biāo)記物制備及鑒定（_）原理:以放射性碘原子通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。因此,凡蛋白質(zhì)、肽類等化合物在結(jié)構(gòu)中含有上述基團(tuán)者，均可用,而對(duì)那些不含上述基團(tuán)的笛體激素或藥物分子，則必須在分子結(jié)構(gòu)上連接相應(yīng)基團(tuán)才能用于放射性碘標(biāo)記。（二）標(biāo)記及類型直

4、接標(biāo)記法：肽類、蛋白質(zhì)和酶的碘化標(biāo)記，其特點(diǎn)是標(biāo)記方法操作簡(jiǎn)便，易得到比放射性較高的標(biāo)記物。常用方法為：氯胺T（ch-T）法；乳過氧化物酶標(biāo)記法。間接標(biāo)記法:也稱聯(lián)接標(biāo)記法，是最常用的間接碘標(biāo)記方法。該法主要用于笛體類化合物、環(huán)核昔酸、前列腺素等缺乏碘標(biāo)記基團(tuán)的小分子化合物的標(biāo)記。（三）高劑量鉤狀效應(yīng)：高劑量鉤狀效應(yīng)（HOO秘應(yīng)）是指當(dāng)標(biāo)本中被測(cè)物濃度超過線性范圍上限時(shí),所得結(jié)果反而降低或呈陰性的現(xiàn)象。第二節(jié)放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素作示蹤劑的標(biāo)記免疫分析方法，它具有高度靈敏性、特異性和精確性等特點(diǎn)，特別適用于激素、多肽等含量微少物質(zhì)的超微量分析。一、基本原理經(jīng)典RIA是

5、采用標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體的反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定（一）抗原抗體反應(yīng)：將未標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）、標(biāo)記抗原和特異性抗體加入反應(yīng)試管中，在一定條件（溫度、時(shí)間及介質(zhì)pH）下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)。（二）分離結(jié)合與游離標(biāo)記物：RIA反應(yīng)平衡后，標(biāo)記抗原與試劑抗體形成免疫復(fù)合物（B）。由于其含量極少，不能自行沉淀，因此需加入適當(dāng)?shù)某恋韯┎拍軐⑵鋸氐壮恋?，然后?jīng)離心使其與游離的標(biāo)記抗原（F）分離。某些小分子抗原，也可采用吸附法分離B與F。理想的分離方法應(yīng)分離徹底、迅速；分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡，而且效果不受反應(yīng)介質(zhì)因素的影響；操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好以及經(jīng)濟(jì)。目前RIA常用的

6、分離方法有以下幾種：第二抗體沉淀法：其原理是用RIA反應(yīng)中的試劑抗體（一抗）如豚鼠的IgG免疫另一種動(dòng)物（如羊），制得羊抗豚鼠IgG血清（二抗）。RIA反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入二抗，使其形成抗原、一抗-二抗的雙抗體復(fù)合物；但因一抗含量甚微，此復(fù)合物也少，不易離心分離，一般還需加入一定量的與一抗同種動(dòng)物的血清或IgG,使其與二抗形成較大量的可見沉淀物，與雙抗體復(fù)合物共沉淀；離心后，即可有效地分離B和F。也可將二抗與某些顆粒固相物連接，制成固相二抗，分離BF效果也好。1. 聚乙二醇（PEG沉淀法：PEG能非特異地沉淀抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白質(zhì)，而不沉淀小分子抗原，因此PEG被廣泛用于RIA實(shí)驗(yàn)作沉淀劑。

7、其優(yōu)點(diǎn)是沉淀完全、經(jīng)濟(jì)方便，但非特異性沉淀較多，且當(dāng)溫度高于30C時(shí)，沉淀物易復(fù)溶。PR試劑法先將二抗與PEGS一定比例混合成懸液后進(jìn)行試驗(yàn)。此法保留了二者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了二者的用量，且分離迅速，簡(jiǎn)便。先將二抗與PEG®一定比例混合成懸液后進(jìn)行試驗(yàn)。此法保留了二者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了二者的用量，且分離迅速，簡(jiǎn)便?；钚蕴课椒ǎ夯钚蕴靠晌叫》肿佑坞x抗原或半抗原，而大分子蛋白（如抗體和免疫復(fù)合物）則留在溶液中?？乖贵w反應(yīng)后，加入活性炭顆粒，使游離的標(biāo)記抗原（F）吸附到顆粒上，再離心使顆粒沉淀，上清液中含有的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）供測(cè)定。該法主要用于測(cè)定小分子抗原或藥物的RIA。（三）放射性

8、測(cè)量及數(shù)據(jù)處理分離B、F后，既可對(duì)標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）進(jìn)行放射性測(cè)量，也可根據(jù)RIA實(shí)驗(yàn)方法及目的，測(cè)定游離標(biāo)記抗原（F）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量-反應(yīng)曲線），樣品管以其測(cè)量或計(jì)算的反應(yīng)參數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出相應(yīng)的待檢抗原濃度。第三節(jié)免疫放射分析免疫放射分析（IRM3是以過量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng),用固相免疫吸附劑對(duì)B或F進(jìn)行分離，其靈敏度和可測(cè)范圍均優(yōu)于RIA，操作程序較RIA簡(jiǎn)單。一、基本原理（一）單位點(diǎn)IRMA先利用過量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物,反應(yīng)平衡后,再用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離,測(cè)定上清液的放射量。

9、（二）雙位點(diǎn)IRMA先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相的抗原的另一抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體，測(cè)定固相上的放射性。兩種IRMA最后測(cè)得的放射性均與樣品中待測(cè)抗原的含量呈正相關(guān)。、IRMA與RIA的比較RIAIRMA標(biāo)記物斥記抗原標(biāo)記抗體反應(yīng)速率抗體過量，反應(yīng)速率稍快反應(yīng)原理競(jìng)爭(zhēng)抑制性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原量成#比非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原濃度呈正相關(guān)特異性雙抗體，反應(yīng)不易受交叉反應(yīng)物干擾，特異性較局靈敏度k原與限量抗體的結(jié)合不充分，靈敏度低微量抗原出與抗體充分結(jié)臺(tái)，靈敏度局檢測(cè)范圍檢測(cè)含量較高抗原標(biāo)本時(shí)，

10、結(jié)果較好標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍寬12個(gè)數(shù)量級(jí)抗體特點(diǎn)n體親和力及特異性高，用量少抗體親和力低，用量多用途測(cè)7E大分子和小分子抗原測(cè)定至少有兩個(gè)抗原決定簇的抗原第四節(jié)放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。但具有放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長(zhǎng)，無(wú)法自動(dòng)化分析等諸多不足?！玖?xí)題】下列有關(guān)放射免疫分析的敘述中，錯(cuò)誤的是A. 以放射性核素作為標(biāo)記物B. 是一種定量檢測(cè)技術(shù)C. 主要用于抗原檢測(cè)D. 形成的免疫復(fù)合物中的放射強(qiáng)度與待測(cè)抗原含量成正比E. 定量分析時(shí)需同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)管正確答案DIRMA為非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，反應(yīng)參答案解析RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制

11、性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原量成反比,數(shù)與待檢抗原濃度呈正相關(guān)。在放射免疫分析檢測(cè)中，B/(B+F)表示(注：B為結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原，F(xiàn)為游離態(tài)的標(biāo)記抗原)A. 結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與總的標(biāo)記抗原之比B. 結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與游離的標(biāo)記抗原之比C. 總標(biāo)記抗原與抗原抗體復(fù)合物之比D. 結(jié)合態(tài)的抗原與總抗體之比E. 結(jié)合態(tài)的抗原與總抗原之比正確答案A答案解析在放射免疫分析檢測(cè)中，B/(B+F)表示：結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與總的標(biāo)記抗原之比。在RIA反應(yīng)系統(tǒng)中，參與反應(yīng)的有標(biāo)記抗原、已知抗體和待測(cè)抗原，對(duì)這三種成分的要求是A. 只需固定標(biāo)記抗原量B. 待測(cè)抗原要先標(biāo)記C. 標(biāo)記抗原和已知抗體的量都是固定量的D. 只需要固定已知抗體的量E. 三者的量均需固定正確答案C答案解析在RIA反應(yīng)系統(tǒng)中，參與反應(yīng)的有標(biāo)記抗原、已知抗體和待測(cè)抗原，對(duì)這三種成分的要求是：標(biāo)記抗原和已知抗體的量都是固定量的。臨床上通常不利于放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)的是A. 微量蛋白質(zhì)B. 激素C. 小分子藥物D. 腫瘤標(biāo)記物E. 免疫球蛋白正確答案E答案解析免疫球蛋白不利于放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)的是。用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析。臨床上放射免疫分析最常用的放射性核素是A. 125Ib. 131ic. 3hd. 14cE.5