免疫組化操作步驟

1、精品文檔免疫組化操作流程試劑準(zhǔn)備1. PBS 緩沖液（ pH7.27.4 ）： NaCl 137mmol/L ，KCl 2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2. 0.01mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g ，檸檬酸 0.4g 。即抗原修復(fù)液3.PBST: PBS+吐溫 -20 （1000:1 ）洗液可全部運(yùn)用PBST4. 3% 甲醇 -H2O2溶液：用 30%H2O2和 80%甲醇溶液配制。5. 封片劑：中性樹脂 +二甲苯。操作流程免疫組織化學(xué)染色SP法：1. 脫蠟、水化：脫蠟前，應(yīng)將切片在60

2、恒溫箱中烘烤60120 分鐘，觀察石蠟應(yīng)溶解。從烤箱拿出切片后盡快置于二甲苯中浸泡30 分鐘，更換二甲苯后再浸泡 30 分鐘；無(wú)水乙醇中浸泡3 分鐘；95%乙醇中浸泡 3 分鐘；70%乙醇中浸泡 3 分鐘（我用 80%）；50%乙醇中浸泡 3 分鐘；自來(lái)水中浸泡 3 分鐘；。1 歡迎下載精品文檔梯度脫蠟2. 抗原修復(fù)：（用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片）高壓熱修復(fù) 高壓鍋里放少許水，用一量杯或容器（大小能容納玻片架為宜）裝抗原修復(fù)液放入高壓鍋里一起煮沸，再放入玻片架，蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，將排氣閥門套上，待聽到閥門冒氣時(shí)，即可倒計(jì)時(shí) 2min，之后將玻片杯一起放入涼水中，靜置15min，平

3、衡至室溫。電磁爐 1000W 2min。3. 丟棄抗原修復(fù)液，將玻片浸泡在去離子水中（時(shí)間不限）可省略4. 用組織筆沿組織邊緣畫線（可與組織邊緣留適當(dāng)間隙） ，畫完立即放入 PBST溶液中浸泡 3 遍 X3min（三個(gè)容器，每個(gè)容器 3min，時(shí)間不限制）。5. 3%H2O2滴加在切片上，室溫靜置 15 分鐘 (3%的 H2O2用 30%的 H2O2加雙蒸水稀釋 10 倍，現(xiàn)配現(xiàn)用。目的為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶) ；6. PBST 洗 3 次各 3 分鐘( 過三缸)7. 滴加正常山羊血清封閉液 , 室溫 30 分鐘。用與一抗不同源的血清即可，本人用 Western-blotting 的含胎牛血清

4、封閉液。8. 甩去封閉液（注：不要沖洗） ，滴加一抗 50ul （至少 50ul 否則易干片），4孵育過夜。 4過夜后需在 37復(fù)溫 45 分鐘（未驗(yàn)證：室溫靜置 1 小時(shí)或者 4過夜或者 371 小時(shí)。）。9. PBST 洗 3 次各 3 分鐘；10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴輔助劑，再滴二抗，之間用 PBST洗三次，每次 3min，每次室溫各靜置 15 分鐘；所用試劑盒為中杉金橋。2 歡迎下載精品文檔的超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑。11. PBST 洗 3 次各 3 分鐘；12. DAB 顯色幾秒至幾分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度； DAB為福州邁新試劑，先配現(xiàn)用。13. PBST 或自來(lái)水沖洗 10 分鐘；14. 蘇木精復(fù)染 20 秒，自來(lái)水分化；15. 自來(lái)水沖洗 30 分鐘；16. 酒精梯度脫水（酒精濃度從低到高，每缸浸泡數(shù)秒即可） 、透明、封片、鏡檢。3