過氧化氫酶的活力和動力學(xué)常數(shù)測定

1、一、酶活力測定（一）原始數(shù)據(jù)1.樣品原始質(zhì)量：嫩豆芽5.010g2.標(biāo)定數(shù)據(jù)：（1）KMnO4質(zhì)量數(shù)及配制：0.02mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液配制：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000mL ，臨用前用草酸鈉標(biāo)定。（2）Na2C2O4質(zhì)量數(shù)：稱取優(yōu)級純Na2C2O4 13.4g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。（3）標(biāo)定數(shù)據(jù)：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于錐形瓶中，加熱至（7585）（見冒熱氣），趁熱用KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，剛開始反應(yīng)較慢，滴入一滴KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液搖動，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此時生成的Mn2+起催化作用）

2、。隨著反應(yīng)速度的加快，滴定速度也可逐漸加快，但滴定中始終不能過快，不斷搖動或攪拌。滴定至溶液呈現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點。2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10CO2+8H2O（4）KMnO4實際濃度：0.019mol/L3.樣品滴定數(shù)據(jù)編號活酶死酶1212加入酶液體積(mL)2.52.52.52.5加入10%H2SO4體積(mL)2.52.52.52.5加入0.1ml/LH2O2體積(mL)2.52.52.52.5加入KMnO4體積(mL)0.230.241.901.94（二）結(jié)果計算1換算系數(shù)（1mL KMnO4溶液相當(dāng)于多少m

3、g H2O2）2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2+2H2O2 5 2 1 1 5 2 1.9*10-5 4.75*10-5 m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg2.樣品酶活計算（每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：mg H2O2/gmin）酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示酶活(mgH2O2/gmin)= 式中： A對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）； F W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.02mol/L的KMnO4

4、相當(dāng)于1.7mg H2O2酶活(mgH2O2/gmin)=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/gmin)二、動力學(xué)常數(shù)的測定（一）原始數(shù)據(jù)編號12345消耗的KMnO4（mL）0.280.350.410.721.33（二）求出各管反應(yīng)前的底物濃度S0和反應(yīng)速度V0編號12345S0 （mol/L）5.000*10-36.700*10-38.700*10-31.250*10-22.500*10-2V0 （mmol/min）7.340*10-31.008*10-21.351*10-22.391*10-23.737*10-2（三）以1/V0對1/S0作圖

5、（用excel作圖）（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）求得線性關(guān)系為y=1.3921x+0.0111所以Vmax=1/0.0111=8.654*10-2 KM=1.205*10-1第四部分：課后研討題1.總結(jié)本實驗操作過程的注意事項。(1)每個三角瓶內(nèi)的酶促反應(yīng)時間要精確控制在5min。(2)各反應(yīng)瓶的滴定終點微紅色應(yīng)為同一標(biāo)準(zhǔn)。(3)使用前，應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應(yīng)該保證逐滴加入。2.影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些?溫度，pH值和底物濃度3.過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)?過氧化氫酶能催化過氧化氫分解為水和氧分子，在此過程中起傳遞電子的作用。4.在反應(yīng)速度

6、的測定中，加入硫酸有哪些作用？提供反應(yīng)所需的酸性條件，并作為反應(yīng)物參與反應(yīng)5.米氏方程中的Km有何實際應(yīng)用？(1)鑒定酶：通過測定Km,可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否是屬于同一種酶。(2)判斷酶的最適底物（天然底物）。(3)計算一定速度下底物濃度。(4)了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平。(5)判斷反應(yīng)方向或趨勢。(6)判斷抑制類型。6.在什么條件下，酶的Km可以作為鑒定酶的一種手段，為什么？Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶濃度無關(guān)。因此，當(dāng)?shù)孜铩H、溫度和離子強度等條件相同時Km值為常數(shù)，對一酶促反應(yīng)而言，在一定的條件下都有特定的K

7、m值，可用來鑒別酶。7.測定酶活力為什么要在進程曲線的初速度時間范圍內(nèi)進行？要進行酶活力測定，首先要確定酶反應(yīng)時間，酶的反應(yīng)時間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度時間范圍內(nèi)選擇?？梢酝ㄟ^進程曲線的制作而求出酶的初速度時間范圍。進程曲線是在酶反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時間測產(chǎn)物生成量的方法，以酶反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進程曲線可知，在曲線起始一段時間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨反應(yīng)時間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，說明酶的反應(yīng)速度下降。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間的延長而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強等原因所致。因此，要真實反映出酶活力大小，就應(yīng)

8、在初速度時間內(nèi)測定。求出酶反應(yīng)初速度的時間范圍是酶動力學(xué)性質(zhì)的一系列研究中的組成部分和必要前提。8.過氧化氫酶的活力測定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活力。請你查閱資料設(shè)計一個應(yīng)用該方法測定過氧化氫酶活力的實驗。過氧化氫酶的活力測定紫外吸收法（參考百度文庫） 一。原理：H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活力。 二。材

9、料、儀器與試劑 （一）、材料：小麥葉片 （二）、儀器（儀器的選擇在實驗開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報告中提出方案后教師審定） 紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水?。?（三）、試劑（試劑的選擇在實驗開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報告中提出方案后教師審定后并配制）0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。 三、實驗操作： 1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后

10、，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?2.測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。 表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表 管 號 S0 S1 S2粗酶液(ml) 0.2（煮死酶液） 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5蒸餾水(ml) 1.0 1.0 1.0 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活力。 五、計算 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（