第八章病原學診斷與防治

1、第一節(jié) 細 菌 學 診 斷細菌學診斷（bacteriological diagnosis）：檢測病原菌及其抗原、產(chǎn)物或核酸血清學診斷（serological diagnosis）:檢測患者血清中特異抗體 嚴格無菌操作，避免標本被污染 根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標本根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標本 盡可能在疾病早期及使用抗菌藥物之前采集標本 采集的標本必須盡快送檢，多數(shù)菌可冷藏送運 標本作好標記，詳細填寫化驗單1、標本（specimens）標本采集與送檢過程中應遵循的原則：一、病原菌檢測顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學顯微鏡 (LM) ：分辨率，0.25m 電子顯微鏡

2、：分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（SEM）：透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性掃描電子顯微鏡（SEM）：細胞或病毒表面特征 1000 10，000 透射電子顯微鏡（TEM）: 病毒或細胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)10,000 100,000普通光學顯微鏡 (LM) :草履蟲染色法：染色劑與細菌細胞質(zhì)的結(jié)合染色法：染色劑與細菌細胞質(zhì)的結(jié)合常用：堿性染色劑（有色的陽離子） 酸性染色劑（負染）單染色法鑒別染色法： 革蘭染色法；原理、步驟、意義 抗酸染色法鞭毛染色等特殊染色法3、分離和鑒定：根據(jù)不同疾病采取不同標本如血、尿、糞便、 咽拭子以及腦脊液

3、等進行細菌的分離和鑒定，是確診細菌性 感染最可靠的方法鑒定的主要內(nèi)容：1）培養(yǎng)特征：根據(jù)細菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征初步診斷2）形態(tài)特征：細菌的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結(jié)構(gòu)3）生化反應：細菌生化反應的特點可作為鑒別細菌的依據(jù)4）血清學鑒定：已知抗體 未知細菌抗原，以確定細菌的種、型5）動物實驗：測定細菌的毒力，及分離病原菌6）藥物敏感試驗；溶血性鏈球菌血平板上的溶血溶血性鏈球菌血平板上的溶血IMViC試驗試驗吲哚試驗 + 甲基紅試驗 + VP試驗 +枸櫞酸鹽利用試驗 +大腸桿菌 產(chǎn)氣桿菌標本采集標本送檢初次涂片染色純培養(yǎng)后再次涂片染色細菌的分離培養(yǎng)挑選可疑菌落進行生化，免疫學，分子生物

4、學檢測4、病原菌抗原的檢測常用于細菌學診斷的免疫學技術(shù)1）沉淀反應2）協(xié)同凝集試驗3）免疫熒光法4）對流免疫電泳5）酶免疫測定6）免疫印跡技術(shù)5、其他檢測法：PCR技術(shù)檢測細菌核酸二、血清學診斷原理：原理：用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的變化變化應用：應用：抗原性較強的致病菌和病程較長的傳染病診斷抗原性較強的致病菌和病程較長的傳染病診斷通常采取雙份血清，如果恢復期或通常采取雙份血清，如果恢復期或1周后血清抗體效價周后血清抗體效價比早期升高比早期升高4倍以上時，則可確認為現(xiàn)癥感染倍以上時，則可確認為現(xiàn)癥感染常用方法：常用方法：直

5、接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達試驗）直接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達試驗）中和試驗（診斷鏈球菌性風濕病的抗中和試驗（診斷鏈球菌性風濕病的抗O試驗）試驗）乳膠凝集試驗、補體結(jié)合試驗乳膠凝集試驗、補體結(jié)合試驗ELISA：技術(shù)簡便、特異、快速、靈敏，應用廣泛第二節(jié)第二節(jié) 病毒學診斷病毒學診斷一、標本的采取與送檢一、標本的采取與送檢注意：注意： 1、對本身帶有雜菌或易受污染的標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應使用抗生素（青霉素，鏈霉素等） 2、標本應低溫保存并盡快送檢 3、血清學診斷標本的采取應在發(fā)病初期和病后23周各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化二、病毒的分離與鑒定二、病毒的分離

6、與鑒定 以下情況需進行病毒的分離與鑒定以下情況需進行病毒的分離與鑒定 分離病毒對診治病人有指導性意義 發(fā)現(xiàn)新的病毒或?qū)σ驯幌麥绲牟《拘约膊?疑“死灰復燃”時 為鑒別臨床上具有相同癥狀的疾病，以明確 何種病毒感染 檢測所用的病毒活疫苗，及時發(fā)現(xiàn)回復毒力 的變異株（一）病毒的分離1、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法按細胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)按細胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：原代細胞：來源于動物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織細胞二倍體細胞：細胞在體外分裂50100代后仍

7、保持2倍染色體數(shù)目的單層細胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)傳代細胞系：多由癌細胞或2倍體細胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標1. 細胞的變化細胞的變化 細胞病變效應細胞病變效應 （CPE）：）：有些病毒在細胞內(nèi)增殖時引起有些病毒在細胞內(nèi)增殖時引起 的特有的細胞病變：細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落的特有的細胞病變：細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落多核巨細胞（融合細胞）形成多核巨細胞（融合細胞）形成：有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、 巨細胞病毒等作用于細胞膜，使鄰近的細胞融合，形成多巨細胞病毒等作用于細胞膜，使鄰近的細胞融合，形成多 核巨細胞。核巨細胞。胞質(zhì)或核

8、內(nèi)包涵體（胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體（inclusion body）的形成）的形成狂犬病病毒、巨細胞病毒狂犬病病毒、巨細胞病毒1、CPE 正常細胞病變細胞巨細胞病毒感染細胞形成的包涵體 貓頭鷹眼狀2. 紅細胞吸附（hemadsorption, HAd）流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現(xiàn)了血凝素（HA），具有吸附脊椎動物（豚鼠、雞、猴等）紅細胞的能力，這一現(xiàn)象稱為紅細胞吸附。常用來鑒定具有HA的黏病毒 或副黏病毒的增殖3.干擾現(xiàn)象（interference）：某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于 測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細胞代謝的改

9、變： 病毒感染細胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標（二）病毒的數(shù)量與感染性的測定：1、蝕斑測定法2、ID50 或 TCID5050%組織細胞感染量：病毒感染細胞后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的病毒量。病毒感染單層細胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱蝕斑。每個蝕斑是由一個感染性病毒體復制，使細胞病變形成的，稱蝕斑形成單位（PFU）。通過計算PFU數(shù)量來得出感染性病毒體的數(shù)量（三）新分離病毒的鑒定：1. 病毒核酸類型的測定2. 理化性狀的檢測3. 形態(tài)學觀察4. 血清學鑒定5. 基因測序和生物對比三、病毒感染的血清學診斷三、病毒感染的血清學診斷原理：原理：用已知

10、病毒抗原來檢測病人血清中有無 相應的抗體 中和試驗（中和試驗（NT testNT test） 補體結(jié)合試驗（補體結(jié)合試驗（CF testCF test） 血凝抑制試驗（血凝抑制試驗（HI testHI test） 凝膠免疫擴散試驗凝膠免疫擴散試驗中和試驗：病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗 患者血清中抗體的消長情況中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和試驗是用于人群免疫情況的調(diào)查，臨床診斷中不常用補體結(jié)合試驗：用已知病毒可溶性補體抗原來檢測病人血清中相應的補體抗體。補體抗原：病毒的內(nèi)部抗原補體抗體的出現(xiàn)可作為近期感染的指標血凝抑制試驗（HI, test）:具有HA的

11、病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，程血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應抗體抑制，稱HI試驗四、病毒感染的快速診斷四、病毒感染的快速診斷（一）形態(tài)學檢查1、電鏡和免疫電鏡2、普通光學顯微鏡檢查 包涵體（二）病毒蛋白抗原檢查: EIA（三）特異性IgM抗體的檢測（四）檢測病毒核酸:1、核酸雜交技術(shù)2、核酸擴增技術(shù)3、基因芯片技術(shù)主要是從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、 IgM抗體和核酸第四節(jié)第四節(jié) 特異性預防與治療特異性預防與治療三、細菌感染的治療第三節(jié)第三節(jié) 真菌學診斷真菌學診斷 細菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素按生物來源分類 真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素 放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素 - -

12、內(nèi)酰胺類 大環(huán)內(nèi)酯類 氨基糖苷類按化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類 四環(huán)類 氯霉素類 人工合成類 其他抗生素類 （一）抗菌藥物的種類（二）抗菌藥物的主要作用機制影響細胞壁的合成（青霉素）影響細胞膜的功能（多黏菌素）影響蛋白質(zhì)的合成（鏈霉素30S亞基, 氯霉素 50S亞基）影響核酸代謝（喹諾酮）影響細胞壁的合成 1、 細菌細胞膜上有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP），在肽聚 糖的合成中起重要作用 2、 青霉素（與 D 丙氨酸 結(jié)構(gòu)相似）能競爭性地結(jié)合其中 的轉(zhuǎn)肽酶，阻滯此酶的功能青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成，對生長旺盛的細菌效果明顯四、病毒感染的治療四、病毒感染的治療五、真菌的治療五、真菌的治療顯微鏡放大法：顯

13、微鏡放大法： 普通光學顯微鏡 (LM) ：分辨率，0.25m 電子顯微鏡：分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（SEM）：透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性（一）病毒的分離1、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法按細胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)按細胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：原代細胞：來源于動物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織細胞二倍體細胞：細胞在體外分裂50100代后仍保持2倍染色體數(shù)目的單層細胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)傳代細胞系：多由癌細胞或2倍體細胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代3.干擾現(xiàn)象（interference）：某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于 測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細胞代謝的改變： 病毒感染細胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標四、病毒感染的快速診斷四、病毒感染的快速診斷（一）形態(tài)學檢查1、電鏡和免疫電鏡2、普通光學顯微鏡檢查 包涵體（二）病毒蛋白