第4章基因工程的主要技術(shù)及其原理

1、第第四四章章 基因工程的主要技術(shù)及其原理基因工程的主要技術(shù)及其原理第一節(jié)第一節(jié) DNADNA和和RNARNA的提取與純化的提取與純化一一 DNA提取的基本原理與方法提取的基本原理與方法（一）（一）DNA提取的基本原理提取的基本原理DNA的性質(zhì)：的性質(zhì)：1) DNA是極性化合物，不溶于有機(jī)溶劑，溶于水，在水中溶解度達(dá)是極性化合物，不溶于有機(jī)溶劑，溶于水，在水中溶解度達(dá)10g/L，其鈉鹽比游離態(tài)更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中，其鈉鹽比游離態(tài)更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。2) DNA與核蛋白復(fù)合體與核蛋白復(fù)合體DNP在在低鹽濃度（在在低鹽濃

2、度（0.1mol/L NaCl）溶液中）溶液中溶解度最低（為水中的溶解度最低（為水中的1%），在高鹽濃度（），在高鹽濃度（1mol/L NaCl）溶液中）溶液中溶解度較高（為水中的溶解度較高（為水中的2倍），而核糖核蛋白倍），而核糖核蛋白R(shí)NP受鹽濃度影響較受鹽濃度影響較小，在低鹽濃度中溶解度仍較大。從而可將小，在低鹽濃度中溶解度仍較大。從而可將DNP和和RNP分開(kāi)。分開(kāi)。 提取和純化提取和純化DNA，首先需破碎或溶解細(xì)胞，用高鹽（，首先需破碎或溶解細(xì)胞，用高鹽（1mol/L NaCl）將）將DNP抽抽提出來(lái)，再把蛋白質(zhì)、多糖、提出來(lái)，再把蛋白質(zhì)、多糖、RNA及無(wú)機(jī)離子除去。及無(wú)機(jī)離子除去。(

3、1). 細(xì)胞裂解和細(xì)胞裂解和DNA的溶解；的溶解；一般采用機(jī)械破碎或酶解細(xì)胞釋放一般采用機(jī)械破碎或酶解細(xì)胞釋放DNA，嚴(yán)防細(xì)胞中各種酶對(duì)，嚴(yán)防細(xì)胞中各種酶對(duì)DNA的的 破壞：破壞：1)利用液氮在超低溫下研磨，使酶失活；利用液氮在超低溫下研磨，使酶失活；2)快速加入緩沖液并迅速混勻，保護(hù)快速加入緩沖液并迅速混勻，保護(hù)DNA。DNA提取的步驟：提取的步驟： EDTA：螯合螯合DNA酶的輔助因子酶的輔助因子Mg2+和和Ca2+，降低，降低DNA酶活性；酶活性； SDS：變性并降解蛋白質(zhì)，降低變性并降解蛋白質(zhì)，降低DNA酶活性；酶活性； 抗氧化劑：抗氧化劑：PVP，-巰基乙醇，抗壞血酸、半胱氨酸，巰基

4、乙醇，抗壞血酸、半胱氨酸，DTT降低酚類氧化降低酚類氧化 對(duì)對(duì)DNA的干擾的干擾 PVP：有效去除酚類和多糖物質(zhì)。有效去除酚類和多糖物質(zhì)。(2). 與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)的去除；等雜質(zhì)的去除；主要利用主要利用DNA與蛋白、多糖性質(zhì)不同，加入離子變性劑、去污劑使其變性解聚；與蛋白、多糖性質(zhì)不同，加入離子變性劑、去污劑使其變性解聚；CTAB: 十六烷基三甲基溴化銨，可溶解細(xì)胞膜，在高鹽溶液中（十六烷基三甲基溴化銨，可溶解細(xì)胞膜，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl） 與與DNA結(jié)合形成復(fù)合物并呈溶解狀態(tài)，但當(dāng)濃度降低到一定程度（結(jié)合形成復(fù)合物并呈溶解狀態(tài)，但當(dāng)濃度

5、降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）時(shí)，）時(shí)，DNA即從溶液中沉淀，通過(guò)離心可將即從溶液中沉淀，通過(guò)離心可將DNA-CTAB復(fù)合物與多糖與復(fù)合物與多糖與 蛋白質(zhì)分開(kāi)。蛋白質(zhì)分開(kāi)。SDS: 十二烷基硫酸鈉，可使蛋白質(zhì)變性，核蛋白解聚，使十二烷基硫酸鈉，可使蛋白質(zhì)變性，核蛋白解聚，使DNA游離出來(lái)，游離出來(lái)， 再根據(jù)再根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度差異，用苯酚和蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度差異，用苯酚-氯仿抽提蛋白。氯仿抽提蛋白。苯酚苯酚-氯仿氯仿: 對(duì)蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)DNA無(wú)影響。無(wú)影響。RNA雜質(zhì)雜質(zhì): 用不含用不含DNA酶的酶的RNA酶

6、去除。酶去除。(3). DNA的沉淀與純化的沉淀與純化溶解在上清液中的溶解在上清液中的DNA加入加入2倍體積的無(wú)水乙醇使其沉淀。倍體積的無(wú)水乙醇使其沉淀。在多糖、蛋白含量高時(shí)用在多糖、蛋白含量高時(shí)用1倍的異丙醇沉淀效果較好。倍的異丙醇沉淀效果較好。（二）（二）DNA提取的幾種方法提取的幾種方法 根據(jù)細(xì)胞破碎后，分離根據(jù)細(xì)胞破碎后，分離DNA與蛋白質(zhì)所采用的技術(shù)策略和試劑不同，可分以與蛋白質(zhì)所采用的技術(shù)策略和試劑不同，可分以下幾種方法：下幾種方法： 1. 濃鹽法濃鹽法原理：根據(jù)原理：根據(jù)RNP和和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。方法方法1：用：用1m

7、ol/L NaCl抽提，得到的抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，離心，液中加入含辛醇的氯仿，離心，DNA位于位于 上層水相，回收水相，用上層水相，回收水相，用2倍體積的倍體積的95%乙醇或無(wú)水乙醇將乙醇或無(wú)水乙醇將DNA沉淀出來(lái)。沉淀出來(lái)。方法方法2：用：用0.15mol/L NaCl反復(fù)洗滌細(xì)胞裂解液除去反復(fù)洗滌細(xì)胞裂解液除去RNP，再用，再用1mol/L NaCl抽提抽提DNP， 然后用氯仿然后用氯仿-異戊醇除去蛋白。異戊醇除去蛋白。以稀鹽溶液提取以稀鹽溶液提取DNA，可加入適量，可加入適量SDS使蛋白質(zhì)變性解聚，使使蛋白質(zhì)變性解聚，使DNA解離；解離；使用使用SSC溶液（溶液（ 5

8、mol/L NaCl、0.015mol/L檸檬酸鈉）抑制檸檬酸鈉）抑制DNase降解降解DNA2. SDS法法原理：原理：SDS使細(xì)胞膜裂解，使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與使細(xì)胞膜裂解，使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與DNA分開(kāi)，分開(kāi)， 加入乙酸鉀可使加入乙酸鉀可使SDS-蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)變成溶解度更小的鉀鹽，使沉淀更加完全。蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)變成溶解度更小的鉀鹽，使沉淀更加完全。 3. CTAB法法原理：在細(xì)胞裂解液中，加入原理：在細(xì)胞裂解液中，加入CTAB分離緩沖液，將分離緩沖液，將DNA溶解出來(lái)。再經(jīng)氯仿溶解出來(lái)。再經(jīng)氯仿-異戊醇異戊醇 抽提除蛋白，即可得到含抽提除蛋白，即可得到含DNA

9、水相，經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀即得到水相，經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀即得到DNA。 4. 苯酚抽提法苯酚抽提法原理：苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可抑制原理：苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚處理細(xì)胞勻漿液，酶的降解作用，用苯酚處理細(xì)胞勻漿液， 蛋白分子溶于酚相，蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，離心分層取水相，多次重復(fù)，合并水相，溶于水相，離心分層取水相，多次重復(fù)，合并水相， 用乙醇沉淀，即得到用乙醇沉淀，即得到DNA。 5. 水抽提法水抽提法原理：利用核酸溶于水的性質(zhì)，用低鹽除去原理：利用核酸溶于水的性質(zhì)，用低鹽除去RNA，將沉淀溶于水中，使，將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解，充分溶解，

10、 離心后收集上清液，加入固體離心后收集上清液，加入固體NaCl調(diào)至調(diào)至2.6mol/L，加入，加入2倍體積的倍體積的95%乙醇，乙醇， 然后，分別用然后，分別用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗乙醇及丙酮清洗DNA，經(jīng)干燥后即得，經(jīng)干燥后即得DNA樣品。樣品。 在強(qiáng)堿環(huán)境中，大分子量的核在強(qiáng)堿環(huán)境中，大分子量的核DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍仍為自然狀態(tài)。將為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并在高鹽環(huán)境中，核調(diào)至中性并在高鹽環(huán)境中，核DNA之間交聯(lián)形之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但質(zhì)粒成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但質(zhì)粒DNA仍然呈可溶狀態(tài)。仍然呈可溶狀態(tài)。 堿裂解法提質(zhì)粒堿裂解法提質(zhì)粒D

11、NA的原理：的原理：（三）質(zhì)粒的提?。ㄈ┵|(zhì)粒的提取二二 RNA提取的基本原理與方法提取的基本原理與方法（一）總（一）總RNA提取的基本原理與方法提取的基本原理與方法1. 總總RNA提取的原理提取的原理真核生物真核生物RNA分子主要存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。分子主要存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中?？偪俁NA：rRNA，tRNA，mRNA。其中。其中mRNA僅占總僅占總RNA的的1- 5% ， 分子大小不等，由幾百乃至數(shù)萬(wàn)核苷酸組成。分子大小不等，由幾百乃至數(shù)萬(wàn)核苷酸組成。能否成功提取能否成功提取RNA，關(guān)鍵在于能否完全抑制或除去，關(guān)鍵在于能否完全抑制或除去RNA酶的破壞作用，酶的破壞作用，獲取完整的全長(zhǎng)

12、獲取完整的全長(zhǎng)RNA分子。分子。RNA酶有一條多肽鏈組成，不需要任何輔助因子，存在十分廣泛并十分穩(wěn)定，酶有一條多肽鏈組成，不需要任何輔助因子，存在十分廣泛并十分穩(wěn)定，非常耐熱，在較寬的非常耐熱，在較寬的pH范圍內(nèi)有活性，及其頑固。范圍內(nèi)有活性，及其頑固。1）所有玻璃器皿應(yīng)置于）所有玻璃器皿應(yīng)置于180烘箱烘烤烘箱烘烤4小時(shí)以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制小時(shí)以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用品需用01%的的DEPC（二乙基焦碳酸鹽）溶液處理，然后（二乙基焦碳酸鹽）溶液處理，然后121 高壓消毒高壓消毒40分鐘；分鐘；2) 全部過(guò)程需戴手套、口罩操作，并經(jīng)常更換手套；全部過(guò)程需戴手套、口罩操

13、作，并經(jīng)常更換手套；3) RNA電泳漕需用去污劑洗滌，用水沖洗干凈后，用乙醇干燥，浸泡于電泳漕需用去污劑洗滌，用水沖洗干凈后，用乙醇干燥，浸泡于3%的的H2O2水溶液中，室溫水溶液中，室溫10分鐘后，再用分鐘后，再用0.1%DEPC水徹底沖洗。水徹底沖洗。提取提取RNA的實(shí)驗(yàn)必須采取以下措施：的實(shí)驗(yàn)必須采取以下措施：1）細(xì)胞的有效破碎，尤其是植物細(xì)胞帶有細(xì)胞壁，研磨要徹底；）細(xì)胞的有效破碎，尤其是植物細(xì)胞帶有細(xì)胞壁，研磨要徹底；2) 使核蛋白復(fù)合體充分變性、解離，使核酸釋放到溶液中；使核蛋白復(fù)合體充分變性、解離，使核酸釋放到溶液中； 變性劑有異硫氰酸胍、變性劑有異硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸鈉

14、等；十二烷基肌氨酸鈉等；3) 有效地抑制內(nèi)源及外源有效地抑制內(nèi)源及外源RNase活性；活性；4) 將將RNA與與DNA、蛋白質(zhì)和多糖分開(kāi)。策略一是先提總核酸，再用氯化鋰將、蛋白質(zhì)和多糖分開(kāi)。策略一是先提總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)；策略二是直接在酸性條件下用酚沉淀出來(lái)；策略二是直接在酸性條件下用酚-氯仿抽提，低氯仿抽提，低pH的酚將使的酚將使RNA進(jìn)入進(jìn)入水相，而蛋白質(zhì)和水相，而蛋白質(zhì)和DNA留在有機(jī)相中，水相中的留在有機(jī)相中，水相中的RNA可用異丙醇沉淀出來(lái)?？捎卯惐汲恋沓鰜?lái)。提取提取RNA的方法一般包括的方法一般包括4個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：2. 總總RNA提取的方法提取的方法(1)

15、酚酚-異硫氰酸胍提取法。異硫氰酸胍提取法。Trizol試劑是最廣泛的抽提總試劑是最廣泛的抽提總RNA的試劑，即根據(jù)酚的試劑，即根據(jù)酚-異硫氰酸胍提取法設(shè)計(jì)。異硫氰酸胍提取法設(shè)計(jì)。提取步驟：提取步驟：在液氮中研磨樣品，使細(xì)胞破碎在液氮中研磨樣品，使細(xì)胞破碎 加入加入Trizol試劑，溶解細(xì)胞成分試劑，溶解細(xì)胞成分 加入氯仿加入氯仿抽提蛋白，離心分離水相和有機(jī)相抽提蛋白，離心分離水相和有機(jī)相 收集含收集含RNA的水相的水相 異丙醇沉淀可獲得異丙醇沉淀可獲得RNA樣品。樣品。(2) 離心分離法。離心分離法。過(guò)柱純化，將含過(guò)柱純化，將含RNA的細(xì)胞破碎液加在含硅膠膜的柱子上，通過(guò)柱子時(shí)，的細(xì)胞破碎液加

16、在含硅膠膜的柱子上，通過(guò)柱子時(shí)，RNA被被硅膠膜吸附，與其他雜質(zhì)分開(kāi)，然后在低鹽溶液或水中將硅膠膜吸附，與其他雜質(zhì)分開(kāi)，然后在低鹽溶液或水中將RNA洗脫下列。洗脫下列。（二）（二）mRNA的提取的提取真核生物真核生物mRNA的提取途徑有兩條：的提取途徑有兩條：其一：抽提細(xì)胞總其一：抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)蛋白酶，經(jīng)蛋白酶K除蛋白，在利用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸纖除蛋白，在利用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸纖 維維 素柱層析，把素柱層析，把mRNA與與tRNA、rRNA分開(kāi)。分開(kāi)。 真核生物真核生物mRNA的的3末端帶有一串長(zhǎng)約末端帶有一串長(zhǎng)約200個(gè)腺苷酸的個(gè)腺苷酸的polyA序列，其他序列，其他RNA 沒(méi)

17、有這樣的結(jié)構(gòu)，從而可用沒(méi)有這樣的結(jié)構(gòu)，從而可用polyT將將mRNA結(jié)合將其分離。結(jié)合將其分離。 基因表達(dá)具有時(shí)空特異性，分離與目的基因時(shí)空表達(dá)相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)具有時(shí)空特異性，分離與目的基因時(shí)空表達(dá)相對(duì)應(yīng)的mRNA是實(shí)驗(yàn)成是實(shí)驗(yàn)成 功的關(guān)鍵。功的關(guān)鍵。其二：先提多聚核糖體，再將蛋白質(zhì)與其二：先提多聚核糖體，再將蛋白質(zhì)與mRNA分開(kāi)，利用抗原抗體反應(yīng)，將微量分開(kāi)，利用抗原抗體反應(yīng)，將微量 特異的特異的mRNA提取出來(lái)。提取出來(lái)。二二 DNA或或RNA濃度、純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定濃度、純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 常用的方法有紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳法。常用的方法有紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電

18、泳法。（一）紫外分光光度計(jì)法測(cè)定（一）紫外分光光度計(jì)法測(cè)定DNA、RNA的濃度和純度的濃度和純度 DNA或或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)具有較強(qiáng)吸收，吸收峰在鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)具有較強(qiáng)吸收，吸收峰在260nm處。處。1個(gè)個(gè)OD260相當(dāng)于相當(dāng)于50ug/mL的雙鏈的雙鏈DNA；1個(gè)個(gè)OD260相當(dāng)于相當(dāng)于40ug/mL的單鏈的單鏈RNA； 蛋白質(zhì)的最大吸收峰在蛋白質(zhì)的最大吸收峰在280nm處，多糖的最大吸收峰在處，多糖的最大吸收峰在230nm處。處。對(duì)于對(duì)于DNA，OD260/OD2801.8，大于，大于1.9表明有表明有RNA污染，小于污染，小于1.6表明表明 有蛋白質(zhì)、苯酚等的

19、污染。有蛋白質(zhì)、苯酚等的污染。對(duì)于對(duì)于RNA, OD260/OD280=1.82.0之間，小于之間，小于1.7表明有蛋白質(zhì)和苯酚污染，表明有蛋白質(zhì)和苯酚污染， 大于大于2.0表明有異硫氰酸胍殘留。表明有異硫氰酸胍殘留。（二）瓊脂糖凝膠電泳鑒定（二）瓊脂糖凝膠電泳鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳可以粗略鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳可以粗略鑒定DNA和和RNA的含量和純度。的含量和純度。EB(溴化乙錠）：溴化乙錠）：DNA的染色劑。該物質(zhì)能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下的染色劑。該物質(zhì)能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下 發(fā)熒光的特性。發(fā)熒光的特性。利用利用EB染色的染色的DNA樣品的亮度可粗略定量，而通過(guò)條帶的清晰

20、度判斷是否降解樣品的亮度可粗略定量，而通過(guò)條帶的清晰度判斷是否降解如果如果DNA有降解，則在電泳圖譜上表現(xiàn)出明顯的拖尾。有降解，則在電泳圖譜上表現(xiàn)出明顯的拖尾。一般用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總一般用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。的質(zhì)量。第二節(jié)第二節(jié) 凝膠電泳凝膠電泳 DNA的等電點(diǎn)偏酸，當(dāng)處于電泳條件（的等電點(diǎn)偏酸，當(dāng)處于電泳條件（pH=8）時(shí)，）時(shí)，DNA鏈上帶有負(fù)電鏈上帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)力的作用下會(huì)向正極泳動(dòng)，由于荷，在電場(chǎng)力的作用下會(huì)向正極泳動(dòng)，由于DNA鏈上負(fù)電荷的增加伴隨著鏈上負(fù)電荷的增加伴隨著DNA分子質(zhì)量的增加而增加。所以，實(shí)際上分子質(zhì)量的增加而增加。所以，實(shí)際上DNA

21、分子的荷質(zhì)比始終是一常數(shù)，分子的荷質(zhì)比始終是一常數(shù)，電泳中分離電泳中分離DNA靠的是分子的大小與構(gòu)型的不同?？康氖欠肿拥拇笮∨c構(gòu)型的不同。 一一 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠（一）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持介質(zhì)，在適當(dāng)條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行分離。瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持介質(zhì)，在適當(dāng)條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行分離。瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，是瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，是D-半乳糖和脫水半乳糖和脫水3,6-L-半乳糖連接而成的一種線性半乳糖連接而成的一種線性分子，具有親水性，不帶電，不引起分子，具有親水性，不帶電，不引起DNA變性，不吸附分離物質(zhì)的特點(diǎn)。

22、變性，不吸附分離物質(zhì)的特點(diǎn)。凝膠的分辨能力與凝膠的類型和濃度有關(guān)。凝膠的分辨能力與凝膠的類型和濃度有關(guān)。不同類型瓊脂糖分離不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小范圍片段大小范圍（二）凝膠電泳的影響因素（二）凝膠電泳的影響因素1、 DNA的分子大小。的分子大小。 線狀雙鏈線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。遷移得越慢。 2、 DNA的分子構(gòu)型。的分子構(gòu)型。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋相同

23、分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的, 超超螺旋螺旋DNA移動(dòng)最快移動(dòng)最快,而開(kāi)環(huán)而開(kāi)環(huán)DNA分子移動(dòng)最慢分子移動(dòng)最慢 。 3、 凝膠濃度。凝膠濃度。一一個(gè)給定大小的線狀個(gè)給定大小的線狀DNA分子分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的分子的大小。大小。 4、 電場(chǎng)強(qiáng)度。電場(chǎng)強(qiáng)度。 電壓一般不超過(guò)電壓一般不超過(guò)5v/cm ，電壓高，電泳快，但分辨率低

24、。電壓低，電泳慢，但，電壓高，電泳快，但分辨率低。電壓低，電泳慢，但分辨率高。分辨率高。5、 溴化乙錠。溴化乙錠。 熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀還會(huì)使線狀DNA遷移率降低遷移率降低15。6、 電泳緩沖液。電泳緩沖液。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤如誤用蒸餾水配制凝膠用蒸餾水配制凝膠),電

25、導(dǎo)率最小電導(dǎo)率最小, DNA幾乎不移動(dòng)幾乎不移動(dòng), 在高離子強(qiáng)度的緩沖液中在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加如誤加10電泳緩沖液電泳緩沖液), 則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱, 嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性變性 。二二 瓊脂糖變性膠電泳瓊脂糖變性膠電泳 RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)堿基容易配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的為單鏈分子，鏈內(nèi)堿基容易配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的RNA分子空間結(jié)構(gòu)分子空間結(jié)構(gòu)不同，在未變性條件下，其相對(duì)分子量與電泳一定距離沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性。不同，在未變性條件下，其相對(duì)分子量與電泳一定距離沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性。常用的常用的RNA變性膠有兩種：變性膠有兩種：其一

26、為含有乙二醛其一為含有乙二醛-二甲基亞砜（二甲基亞砜（DMSO）的凝膠；）的凝膠；其二為含甲醛的凝膠。其二為含甲醛的凝膠。 水平電泳水平電泳三三 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 垂直電泳垂直電泳 聚丙烯酰胺凝膠，既具有分子篩效應(yīng)，又具有靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊聚丙烯酰胺凝膠，既具有分子篩效應(yīng)，又具有靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊脂糖凝膠，可達(dá)一個(gè)核苷酸。同時(shí)又可用于蛋白質(zhì)的分離。脂糖凝膠，可達(dá)一個(gè)核苷酸。同時(shí)又可用于蛋白質(zhì)的分離。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，需要自聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。由基催化完成。常用的催化方法有

27、化學(xué)聚合和光聚合：常用的催化方法有化學(xué)聚合和光聚合：化學(xué)聚合需加入催化劑過(guò)硫酸銨化學(xué)聚合需加入催化劑過(guò)硫酸銨(AP）和加速劑四甲基乙二胺（）和加速劑四甲基乙二胺（TEMED)。光聚合是核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)產(chǎn)生自由基使凝膠聚合。光聚合是核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)產(chǎn)生自由基使凝膠聚合。 聚丙烯酰胺凝膠制備在玻璃板上或玻璃管中。聚丙烯酰胺凝膠制備在玻璃板上或玻璃管中。電泳漕分上漕和下漕，各裝有電極，通過(guò)凝膠使它們連成導(dǎo)電的整體。電泳漕分上漕和下漕，各裝有電極，通過(guò)凝膠使它們連成導(dǎo)電的整體。電泳中帶有電荷的分子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)，移動(dòng)速度依賴于電場(chǎng)強(qiáng)度、分電泳中帶有電荷的分子在電場(chǎng)作用

28、下移動(dòng)，移動(dòng)速度依賴于電場(chǎng)強(qiáng)度、分子凈電荷以及分子的大小和形狀，同時(shí)也與介質(zhì)的離子強(qiáng)度、黏度和溫度子凈電荷以及分子的大小和形狀，同時(shí)也與介質(zhì)的離子強(qiáng)度、黏度和溫度有關(guān)。有關(guān)。四四 脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳 常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，在一定的分子量范圍內(nèi)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，在一定的分子量范圍內(nèi)DNA片段泳動(dòng)速率與分片段泳動(dòng)速率與分子量大小呈線性關(guān)系，但當(dāng)子量大小呈線性關(guān)系，但當(dāng)DNA分子大小超過(guò)凝膠孔徑，分子大小超過(guò)凝膠孔徑，DNA分子將由無(wú)分子將由無(wú)規(guī)則卷曲的構(gòu)象沿電場(chǎng)方向伸直，變成與電場(chǎng)平行以通過(guò)凝膠空隙，這樣規(guī)則卷曲的構(gòu)象沿電場(chǎng)方向伸直，變成與電場(chǎng)平行以通過(guò)凝膠空隙，這樣大分子通過(guò)凝膠的

29、速率無(wú)差別，因此無(wú)法區(qū)分。大分子通過(guò)凝膠的速率無(wú)差別，因此無(wú)法區(qū)分。 脈沖電場(chǎng)電泳是一種交替變換電場(chǎng)方向的電泳，以一定的角度并以一定脈沖電場(chǎng)電泳是一種交替變換電場(chǎng)方向的電泳，以一定的角度并以一定的時(shí)間變換電場(chǎng)的方向，使的時(shí)間變換電場(chǎng)的方向，使DNA在微觀上按在微觀上按“Z”形向前泳動(dòng)，從而區(qū)分不形向前泳動(dòng)，從而區(qū)分不同大小的同大小的DNA分子。分子。 脈沖場(chǎng)電泳可區(qū)分脈沖場(chǎng)電泳可區(qū)分50kb或或100kb以上的大片段以上的大片段DNA分子。分子。五五 凝膠電泳中凝膠電泳中DNADNA的檢測(cè)的檢測(cè)凝膠中凝膠中DNA的檢測(cè)方法主要有三種：的檢測(cè)方法主要有三種：1. EB染色，然后在紫外燈下觀察，主

30、要用于瓊脂糖凝膠；染色，然后在紫外燈下觀察，主要用于瓊脂糖凝膠；2. 銀染顯色法，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳；銀染顯色法，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳；3. 放射性同位素標(biāo)記發(fā)，放射性同位素標(biāo)記發(fā)，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。第三節(jié)第三節(jié) 核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交 核酸分子雜交原理：核酸分子雜交原理：雙鏈雙鏈DNA或具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的或具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA變性后，其變性后，其具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈的退火或復(fù)性過(guò)程。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈的退火或復(fù)性過(guò)程。 形成的分子有形成的分子有DNA/DNA,DNA/RNA雜合分子形式。雜合分子形式。一一 探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記 探針

31、：探針：是指用于檢測(cè)特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的是指用于檢測(cè)特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達(dá)的DNA、RNA或寡核苷酸序列，這些序列使用前需要標(biāo)記?；蚬押塑账嵝蛄?，這些序列使用前需要標(biāo)記。 標(biāo)記：標(biāo)記：同位素標(biāo)記，同位素標(biāo)記， 生物素、地高辛或辣根過(guò)氧化物酶等標(biāo)記生物素、地高辛或辣根過(guò)氧化物酶等標(biāo)記（一）探針的制備（一）探針的制備（1）切口平移法標(biāo)記）切口平移法標(biāo)記通過(guò)復(fù)制合成新探針?lè)肿樱趶?fù)制過(guò)程中摻入標(biāo)記核苷酸通過(guò)復(fù)制合成新探針?lè)肿?，在?fù)制過(guò)程中摻入標(biāo)記核苷酸,從而使整個(gè)從而使整個(gè)分子被均勻標(biāo)記。分子被均勻標(biāo)記。特點(diǎn)：均勻標(biāo)記，探針信號(hào)強(qiáng)。特點(diǎn)：均勻標(biāo)記，探針信號(hào)強(qiáng)。1. 均勻標(biāo)記均勻標(biāo)記（

32、2）隨機(jī)引物法）隨機(jī)引物法（3）PCR擴(kuò)增標(biāo)記擴(kuò)增標(biāo)記 利用利用6個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物在個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物在Klenow酶的作用下，對(duì)待檢測(cè)的酶的作用下，對(duì)待檢測(cè)的DNA進(jìn)行進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入隨機(jī)擴(kuò)增，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入32pdATP，擴(kuò)增產(chǎn)物用作探針，擴(kuò)增產(chǎn)物用作探針 在在PCR擴(kuò)增時(shí)加入標(biāo)記的擴(kuò)增時(shí)加入標(biāo)記的dNTP，可獲得大量探針。，可獲得大量探針。2. 末端標(biāo)記末端標(biāo)記 直接將探針?lè)肿拥哪硞€(gè)原子替換成放射性同位素原子，或直接在探針?lè)种苯訉⑻结樂(lè)肿拥哪硞€(gè)原子替換成放射性同位素原子，或直接在探針?lè)肿蛹由蠘?biāo)記的原子或復(fù)合物。這種標(biāo)記一般在探針?lè)肿拥哪┒诉M(jìn)行，故稱子加上標(biāo)記的原子或復(fù)合

33、物。這種標(biāo)記一般在探針?lè)肿拥哪┒诉M(jìn)行，故稱為末端標(biāo)記。為末端標(biāo)記。（1） DNA片段的末端標(biāo)記片段的末端標(biāo)記 a. 黏末端的補(bǔ)平反應(yīng)或平末端的置換反應(yīng)引入標(biāo)記的核苷酸；黏末端的補(bǔ)平反應(yīng)或平末端的置換反應(yīng)引入標(biāo)記的核苷酸； b.T4多核苷酸激酶在多核苷酸激酶在DNA的的5末端引入標(biāo)記的磷酸基團(tuán)；末端引入標(biāo)記的磷酸基團(tuán)； c. 末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶在DNA的的3末端連接標(biāo)記的核苷酸。末端連接標(biāo)記的核苷酸。（2）. 寡核苷酸的標(biāo)記寡核苷酸的標(biāo)記 用用DNA聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成兩個(gè)部分互補(bǔ)的聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成兩個(gè)部分互補(bǔ)的寡核苷酸使之互為模板，在寡核

34、苷酸使之互為模板，在DNA合成的過(guò)程中引入標(biāo)記的寡核苷酸。合成的過(guò)程中引入標(biāo)記的寡核苷酸。（二）標(biāo)記物及其檢測(cè)（二）標(biāo)記物及其檢測(cè)同位素同位素32P: 半衰期為半衰期為14天，放射性粒子穿透能力強(qiáng)；天，放射性粒子穿透能力強(qiáng)；33P：半衰期為：半衰期為25天，但產(chǎn)生的信號(hào)較弱。天，但產(chǎn)生的信號(hào)較弱。非同位素標(biāo)記有：非同位素標(biāo)記有：生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記，地高辛標(biāo)記地高辛標(biāo)記和和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記等。等。地高辛標(biāo)記由德國(guó)地高辛標(biāo)記由德國(guó)Roche公司開(kāi)發(fā)，將公司開(kāi)發(fā)，將DIG與與dUTP交聯(lián)，在摻入核苷酸標(biāo)記反交聯(lián)，在摻入核苷酸標(biāo)記反應(yīng)中引入應(yīng)中引入DIG-11-dUTP，使，使D

35、NA或或RNA被被DIG標(biāo)記。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記標(biāo)記。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中的中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的沉淀。酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的沉淀。生物素是一種水溶性維生素，可通過(guò)丙烯鍵與嘧啶的生物素是一種水溶性維生素，可通過(guò)丙烯鍵與嘧啶的C5位共價(jià)結(jié)合，形成位共價(jià)結(jié)合，形成biotin-11-dUTP，顯色原理同，顯色原理同DIG 。辣根過(guò)氧化物酶（辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標(biāo)記的探針是通過(guò)標(biāo)記的探針是通過(guò)HRP與帶正電荷的聚乙烯亞胺交聯(lián)產(chǎn)與帶正電荷的聚

36、乙烯亞胺交聯(lián)產(chǎn)生帶正電荷的復(fù)合物，再與帶負(fù)電荷的單鏈或雙鏈生帶正電荷的復(fù)合物，再與帶負(fù)電荷的單鏈或雙鏈DNA結(jié)合形成共價(jià)鍵，產(chǎn)生結(jié)合形成共價(jià)鍵，產(chǎn)生酶標(biāo)記探針，酶可使無(wú)色底物顯色，從而進(jìn)行檢測(cè)酶標(biāo)記探針，酶可使無(wú)色底物顯色，從而進(jìn)行檢測(cè) 。二二 SouthernSouthern雜交雜交Southern雜交示意圖雜交示意圖三三 NorthernNorthern雜交雜交總總RNA或或mRNA甲醛變性瓊脂糖電泳甲醛變性瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)膜印跡轉(zhuǎn)膜預(yù)預(yù)雜交雜交雜交（變性探針）雜交（變性探針） 洗膜洗膜放射自顯影或顯色放射自顯影或顯色四四 菌落或噬菌斑雜交菌落或噬菌斑雜交菌落原位雜交示意圖菌落原位雜交示意

37、圖五五 WesternWestern雜交雜交PVDF膜膜目的蛋白質(zhì)目的蛋白質(zhì)抗目的蛋白的第一抗體抗目的蛋白的第一抗體羊抗家兔羊抗家兔IgG的第二抗體的第二抗體偶聯(lián)的堿性磷酸酶偶聯(lián)的堿性磷酸酶磷酸化生色體系磷酸化生色體系顯色顯色第四節(jié)第四節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)一一 PCR技術(shù)原理技術(shù)原理PCR( Polymerase Chain Reaction):一種在模板一種在模板DNA、引物和引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下利用種脫氧核糖核苷酸存在的條件下利用DNA聚合聚合酶的酶促反應(yīng)。酶的酶促反應(yīng)。DNA的體外復(fù)制的體外復(fù)制v高溫變性高溫變性: : 92-96 92-96 v低溫退

38、火低溫退火: : 37-7237-72 v適溫延伸適溫延伸: : 7272 （一）（一） PCR技術(shù)的基本過(guò)程技術(shù)的基本過(guò)程55333355變性、退火、延伸變性、退火、延伸循環(huán)循環(huán)n n次次一一次次循循環(huán)環(huán)兩兩次次循循環(huán)環(huán)變性變性55333355退火退火555533335533延伸延伸553333555533n n次循環(huán)后次循環(huán)后雙鏈雙鏈DNADNA在在理論上的最高值為理論上的最高值為2 2n n（二）（二） 平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)形成與下列因素有關(guān)：平臺(tái)效應(yīng)形成與下列因素有關(guān)：平臺(tái)效應(yīng)：平臺(tái)效應(yīng)：PCR反應(yīng)經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的指數(shù)積累趨反應(yīng)經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)后，

39、隨著產(chǎn)物的指數(shù)積累趨于飽和，于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，而是進(jìn)人線性增長(zhǎng)或靜止期。片段不再呈指數(shù)積累，而是進(jìn)人線性增長(zhǎng)或靜止期。（1）引物、）引物、dNTP快速摻入底物中，其濃度降低，摻入速度減慢；快速摻入底物中，其濃度降低，摻入速度減慢；（2）隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降；）隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降；（3）非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)；）非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物競(jìng)爭(zhēng)；（4）產(chǎn)物的再結(jié)合。）產(chǎn)物的再結(jié)合。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖二二 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系PCR反應(yīng)需用一定的條件才能完成，這些條件主要指：反應(yīng)需用一定的條件才能完成，這些條件

40、主要指：v1010 緩沖液（緩沖液（MgMg2+2+）vDNADNA模板模板vdNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTPdNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTP) )v一對(duì)引物一對(duì)引物vDNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）v無(wú)菌水（補(bǔ)足體系用）無(wú)菌水（補(bǔ)足體系用）（一）（一）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶v以單鏈以單鏈DNADNA為模板，以引物為起點(diǎn)，按為模板，以引物為起點(diǎn)，按5533方方向合成新生互補(bǔ)鏈向合成新生互補(bǔ)鏈v無(wú)無(wú)3355外切酶活性外切酶活性v耐高溫（耐高溫（95 95 C C）v最適合成最適合成DNADNA溫度為溫度為72 72 C C（二）引物（

41、二）引物v引物長(zhǎng)度引物長(zhǎng)度(16-30bp)(16-30bp)退火退火5555333355333355變性變性55333355v防止一對(duì)引物內(nèi)及引物之間同源性，避免形成引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或防止一對(duì)引物內(nèi)及引物之間同源性，避免形成引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或“二聚體二聚體”vGCGC含量為含量為40%-60%40%-60%，兩引物的，兩引物的TmTm值相近，值相近， Tm = 2Tm = 2（A+TA+T）+ 4+ 4（G+CG+C）v引物引物33端不能進(jìn)行修飾或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；端不能進(jìn)行修飾或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；v引物的引物的55端可進(jìn)行修飾，如添加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等端可進(jìn)行修飾，如添加酶切位點(diǎn)；標(biāo)

42、記生物素、熒光、地高辛等 引入突變位點(diǎn)、插入或缺失突變序列等。引入突變位點(diǎn)、插入或缺失突變序列等。（三）（三）PCRPCR反應(yīng)的最佳條件反應(yīng)的最佳條件vTaqTaq DNA DNA聚合酶的濃度為聚合酶的濃度為1.0-2.5U/100uL1.0-2.5U/100uL反應(yīng)液；反應(yīng)液；vdNTPdNTP的濃度為的濃度為20-200umol/L;20-200umol/L;vMgMg2+2+濃度為濃度為0.5-2.5mmol/L0.5-2.5mmol/L；v引物濃度為引物濃度為0.2-1.0umol/L0.2-1.0umol/L。三三 PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用（一）（一） 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR（二）（二） 錨定錨定PCR（三）（三） 反向反向PCR（四）（四） 巢式巢式PCR設(shè)計(jì)一對(duì)外測(cè)引物和一對(duì)內(nèi)測(cè)引物設(shè)計(jì)一對(duì)外測(cè)引物和一對(duì)內(nèi)測(cè)引物先用外測(cè)引物擴(kuò)增含目的先用外測(cè)引物擴(kuò)增含目的DNA的大片段的大片段再用內(nèi)測(cè)引物以擴(kuò)增的大片段為模板擴(kuò)增目的再用內(nèi)測(cè)引物以擴(kuò)增的大片段為模板擴(kuò)增目的DNA片段片段模板模板DNA加外側(cè)引物加外側(cè)引物A和和B引物引物A 引物引物BPCR加內(nèi)側(cè)引物加內(nèi)側(cè)引物C和和D引物引物CPCR 引物引物D巢式巢式PCR示意圖示意圖（五）（五） 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR 在普通在普通PCR 儀的基礎(chǔ)上再配備一個(gè)激發(fā)和檢測(cè)的裝置。通過(guò)儀的基礎(chǔ)上再配備一個(gè)激發(fā)和檢測(cè)