實時熒光定量PCR(RT-qPCR)完全手冊

1、實時熒光定量PCR (RT-qPCR )完全手冊所謂的實時熒光定量 PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起 始模板定量及定性的分析。 RT-qPCR是由三個步驟組成 RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Key porint) 關鍵詞：熒光實時實時熒光定量 PCRRT-qPCRRT-PCR反轉(zhuǎn)錄定量PCRQRT-PCR方法簡介所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中,引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例

2、增加。 每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。RT-qPCR是由三個步驟組成：1 .反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;2 .擴增:用PCR的方法擴增 cDNA;3 .檢測:實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物.RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點 (Key porint):1 .分析結(jié)果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測方法設計2 .反轉(zhuǎn)錄反應的非標準化影響試驗的穩(wěn)定性3 .數(shù)據(jù)分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結(jié)果中會得到混淆的錯誤結(jié)果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質(zhì)量評價以達到最小化變異性，最大化

3、可重復性，而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分 析相適應的。Figure 1 | Steps involved in planning a RT-qPCR assay. The numerous permutations illustrate the atteriutives and potential for variabiUty associated with this techniqueqpcn vuaaOan and ogtniQaoonKnmptDviiditon ond Qiporirrwmii mta aw“ 曰 ionJF!?1

4、 sikec eon, cotton.soparaio ntractan1ANA 由gm 總皿聘部-30 PFigure 2 總T-*CRe( ped mental wriflcw.Ttw four main themes (assay validation optimization, sample validation and data coUectiort RT-KR assay and data analysis) are highlighted In different cdo5.存在的問題由于各個學術團體和科研機構(gòu)使用不同的操作流程，必然導致大家使用不同定量的來源物以及數(shù)據(jù)分析：1

5、.新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品2 .整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞3 .總RNA或者mRNA4 .RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的不同的引發(fā)策略5 .不同的酶以及酶的不同組合6 .變異系數(shù)、靈敏度7 .多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環(huán)儀的分析以及匯報方式。8 .每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內(nèi)參的使用，歸一化的方法，質(zhì)量控 制等等因素嚴重影響 RT-qPCR的可信度，重復性。RNA質(zhì)量評價現(xiàn)在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course (http:/www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/conf 28 )比較了用

6、 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan odrop and the BioRadExperion 來定量同樣的樣品。結(jié)果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數(shù)據(jù)。所以用不同的方法進行定量是不明智的。因此，我們需要用統(tǒng)一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。RNA質(zhì)量RNA質(zhì)量主要包括 RNA的純度（沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染）以及完整性。傳統(tǒng)的 RNA質(zhì)量的評價通過分析 A260/A280的比值或者對 瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agile nt Bioanalyser/BioRadExperion微流體毛細電泳系統(tǒng)也

7、是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析 RNA質(zhì)量的方法，它通過分析18S以及28S rRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應 RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數(shù)（ RIN）來反應。樣品 的RINs在10-4之間。10代表完整的 RNA , 4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非 100 %準確定反應 mRNA的完整性，因為他們只是反應rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用 GAPDH的3: 5分析法。W33 3 biQOSQ 冊3GAPDM mRNA4AAAA*A1JM 0 M017 HEX qoeG2G Cyfi 4M我們使用o

8、ligodT進行逆轉(zhuǎn)錄，然后對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產(chǎn)物。探針設計的位點分別位于3;以及中部。擴增產(chǎn)物的之間的比值反應RNA的完整性。如果3 ;5勺比值在1,反應較高度完整性，如果高于5說明降解。QRT-PCR抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴重減少了 PCR的靈敏度以及熱動力學反應，高度的抑制還導致假陰性的 結(jié)果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin 以及 IgG. 是否有抑制物的評價體系：1 .通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測2 .通過內(nèi)部擴增

9、對照來反應樣品處理過程中樣本的情況3 .用細菌基因組檢測臨床樣品的抑制4 .通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應目標檢測物的抑制情況反轉(zhuǎn)錄反應系統(tǒng)1 .RT和PCR單一酶系統(tǒng)2 .RT和PCR分離的酶系統(tǒng)3 .RNA逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇 引物主要有三種：1.隨機引物：隨機引物，特別是 6nt引物對所有的靶位點不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的結(jié)果，建議使用15nt的隨機引物.2.oligo-dT :只能用于mRNA完整的樣品，特別有 polyA .而且對于一些特殊的變異體以及 較長的3 UTR勺區(qū)域比較困難3.特異引物：最特異最靈敏的方法。特別 RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有

10、： 1.引物的濃度2.建議使用SYBR Green I和EvaGreen進行擴增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程：I .靶的選擇和試驗設計1.針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴增引物，探針以及反應條件.RTPrimerDB (http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb ),PrimerBank (/primerbank/index.html ) Real Time PCR Primer Sets ( ) 如果

11、沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考，以下的設計方案僅供參考：A.最廣泛使用的商業(yè)化的軟件Beacon Designer( )B.DIY 的軟件 Primer ExpressC.如果Beacon Designer無法得到您說需要的結(jié)果，或者獲得到設計方案的備選數(shù)目不夠 的話,可以選擇Sigma-Genosys http:)的服務方案，詳細周到D.一個免費的基于網(wǎng)頁構(gòu)架的引物和探針設計程序：s/probe design.asp您可以挑選其中的 4-6對引物進行試驗，選擇引物的擴增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網(wǎng)站進行比對，并且用NCBI的ePCR進行虛擬的電子 PCR引物設計簡介

12、DNA引物長度:15-25個堿基GC含量：50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合，可以考慮用LNA替換幾個堿基，較少引物的長度以及避免引 物次級結(jié)構(gòu)和3端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭，分之內(nèi)雜交，倒轉(zhuǎn)重復等等會引起引物的引發(fā)探針對結(jié)合效率達降低，因此我們選擇引物二聚體的AG為負值，即:10 kcal/mol.沒有連續(xù)的 G/C. 引物探針的保存一般遵循以下原則：正向和反向引物保存在-20度，濃度為10mM或者10X工作濃度.探針應該避光保存，貯存 在-70度，最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。2 .輸入靶序列，用 BLASTn 在 http:w

13、/blast進行比對3 .檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進行引物和探針設計4 .在靶序列中避免直接待重復區(qū)，在重復區(qū)進行雜交容易使得引物非獲得產(chǎn)物性結(jié)合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。5 .考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過生物信息學分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內(nèi)含子區(qū)，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用基因組DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟的做法是讓下游引物跨越剪接接 頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。6 .在 RT 步驟時，用(/applications/mfold/