細(xì)胞因子檢測技術(shù)課件

1、細(xì)胞因子檢測技術(shù)第一頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)細(xì)胞因子細(xì)胞因子（cytokine, CK）指由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）合成與分泌(fnm)的，具有多種生物功能的小分子蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。因能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能而得名?？山閷?dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等。細(xì)胞因子一、細(xì)胞因子概述一、細(xì)胞因子概述(i sh)第二頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)以生物學(xué)作用進(jìn)行以生物學(xué)作用進(jìn)行(jnxng)劃分的分類劃分的分類白細(xì)胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干擾素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-

2、腫瘤壞死(hui s)因子（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor） TGF- 趨化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生長因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF第三頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù) 細(xì)胞因子間的相互作用細(xì)胞因子間的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 T

3、GFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞TB第四頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù) 二、二、 細(xì)胞因子檢測細(xì)胞因子檢測(jin c)(jin c)的方法與原理的方法與原理（一）細(xì)胞(xbo)生物學(xué)檢測（二）免疫學(xué)檢測（三）分子生物學(xué)檢測第五頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)1、細(xì)胞

4、增殖或增殖抑制(yzh)試驗(yàn)2、細(xì)胞毒活性測定3、抗病毒活性測定法4、細(xì)胞趨化活性測定法（一）細(xì)胞（一）細(xì)胞(xbo)生物學(xué)檢測生物學(xué)檢測第六頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)1、細(xì)胞、細(xì)胞(xbo)增殖和增殖抑制測定法增殖和增殖抑制測定法 以細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞株為靶向，通過觀以細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞株為靶向，通過觀察特定的細(xì)胞因子刺激或抑制察特定的細(xì)胞因子刺激或抑制(yzh)依賴性依賴性細(xì)胞株增殖來評(píng)估細(xì)胞因子的活性水平。細(xì)胞株增殖來評(píng)估細(xì)胞因子的活性水平。 常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。等。

5、其中測定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比其中測定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比色法包括色法包括 MTT、XTT、MTS和和NAG等等方方法。法。第七頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù) 通過檢測細(xì)胞通過檢測細(xì)胞DNADNA合成的增加或減少來判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的合成的增加或減少來判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過程中，增殖過程中，DNADNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記苷標(biāo)記(bioj)(bioj)上可以示蹤的同位素（上可以示蹤的同位素（3 3H/H/125125I I ），通過檢測細(xì)胞內(nèi)的同位素），通過檢測細(xì)胞內(nèi)的

6、同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果結(jié)果(ji gu)(ji gu)客觀易于自動(dòng)化；客觀易于自動(dòng)化；適用于大標(biāo)本量的測定適用于大標(biāo)本量的測定 方法的特異性受依賴細(xì)胞方法的特異性受依賴細(xì)胞株影響；放射性污染株影響；放射性污染(1) (1) 放射性核素?fù)饺敕ǚ派湫院怂負(fù)饺敕ǖ诎隧摚踩?。?xì)胞因子檢測技術(shù)特點(diǎn)：不使用放射性核素，特點(diǎn)：不使用放射性核素， 以細(xì)胞代謝變化以細(xì)胞代謝變化(binhu)(binhu)為增殖指征為增殖指征 指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān)指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān) 測定測定(cdng)(cdng)步驟步驟類似類似與同位

7、素?fù)饺敕ㄏ啾扰c同位素?fù)饺敕ㄏ啾?xin b)摻入物：摻入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、 培培養(yǎng)時(shí)間不同養(yǎng)時(shí)間不同(2) MTT (2) MTT 比色法比色法第九頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)2、細(xì)胞毒活性測定(cdng) 對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，待測細(xì)胞因子作一系列稀釋后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，待測細(xì)胞因子作一系列稀釋后加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作為為(

8、zuwi)判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性呈正判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性呈正比。應(yīng)用系列稀釋的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，制作其活性與劑比。應(yīng)用系列稀釋的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，制作其活性與劑量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為(zuwi)待測品活性的定量待測品活性的定量測定的基礎(chǔ)。測定的基礎(chǔ)。 本法常用本法常用(chn yn)于于TNF等的測定等的測定第十頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)Wish、Hep2/c 人干擾素人干擾素L929 小鼠干擾素小鼠干擾素Ratec 大鼠干擾素大鼠干擾素A549MDBK 多種族多種族(zhngz)的的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNI

9、FN等的測定等的測定，IFNIFN可誘導(dǎo)細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞(xbo)(xbo)產(chǎn)生抑制產(chǎn)生抑制病毒病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保護(hù)細(xì)胞合成的酶，保護(hù)細(xì)胞(xbo)(xbo)不受病毒感染，產(chǎn)生不受病毒感染，產(chǎn)生細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)病變效應(yīng)（病變效應(yīng)（CPECPE）。）。 VSV、EMCV及及Sindbis virus等等細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒抑制病毒(bngd)蝕斑形成或抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒(bngd)的產(chǎn)量的產(chǎn)量3 3、抗病毒活性測定法、抗病毒活性測定法常用于檢測抗病毒活性的細(xì)胞株常用于檢測抗病毒活性的細(xì)胞株常用于攻擊細(xì)胞的病毒常用于攻擊細(xì)胞的病毒

10、檢測抗病毒活性的方法檢測抗病毒活性的方法第十一頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)趨化性趨化性(chemotaxis)(chemotaxis)： 誘導(dǎo)細(xì)胞向由誘導(dǎo)細(xì)胞向由趨化因子低濃度處向趨化因子低濃度處向趨化因子高濃度處作定向移動(dòng)的趨化因子高濃度處作定向移動(dòng)的特性特性, ,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)(shyn)(shyn)?；瘜W(xué)增活性化學(xué)增活性(chemokinesis)(chemokinesis)： 細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性, ,可采用瓊脂糖可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測。小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測。趨化因子誘導(dǎo)

11、趨化因子誘導(dǎo)(yudo)(yudo)細(xì)胞移動(dòng)的方式細(xì)胞移動(dòng)的方式4 4、趨化活性測定法、趨化活性測定法第十二頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)濾膜：計(jì)數(shù)(j sh)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞(xbo)趨化試驗(yàn)原理趨化試驗(yàn)原理(yunl)示示意意第十三頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞的選擇(xunz)與培養(yǎng)與培養(yǎng)1、對(duì)所測的細(xì)胞因子有特異的敏感性2、易培養(yǎng)、保存(bocn)、生物學(xué)特性穩(wěn)定3、有良好的生長狀態(tài)4、種屬適配第十四頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)各類細(xì)胞因子檢測各類細(xì)胞因子檢測(jin c)的常用靶細(xì)的常用靶細(xì)胞胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)(shyn)系統(tǒng) 干擾因素IL-1 D10（

12、M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4第十五頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)各類細(xì)胞因子檢測各類細(xì)胞因子檢測(jin c)的常用靶細(xì)胞的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 干擾因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性(zhngxng)粒細(xì)胞（

13、M、H）趨化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）細(xì)胞毒法IFN wish（H）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- L929（M）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- 第十六頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)敏感性較高敏感性較高特異性不高特異性不高操作操作(cozu)(cozu)繁瑣繁瑣易受干擾易受干擾生物學(xué)活性測定方法學(xué)評(píng)價(jià)生物學(xué)活性測定方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)(pngji)第十七頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)（二）免疫學(xué)檢測（二）免疫學(xué)檢測(jin c)細(xì)胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體( 單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通

14、過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示， 從而定性(dng xng)或定量顯示細(xì)胞因子(或受體)的水平。1、ELISA法2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)3、流式細(xì)胞分析法第十八頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)1 1、ELISAELISA方法方法(fngf)(fngf)ELISAELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISAELISA的基本步驟的基本步驟(bzhu)(bzhu)，可作定性或定量分析。可作定性或定量分析。ELISAELISA法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測

15、，也法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測，也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測定可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測定 第十九頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)敏感性偏低敏感性偏低不能判斷不能判斷(pndun)(pndun)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISAELISA特異、簡便特異、簡便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理可同時(shí)檢測大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理細(xì)胞因子測定細(xì)胞因子測定(cdng)(cdng)的首選方法的首選方法第二十頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)2 2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(shyn)(sh

16、yn)(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot) ElisaSpot) 在包被有待測細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分在包被有待測細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測細(xì)胞，經(jīng)在有或無刺激物存在的泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測細(xì)胞，經(jīng)在有或無刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周圍，并被板條件下培養(yǎng)，待測細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲上的特異性抗體捕獲(bhu)(bhu)。后續(xù)的反應(yīng)如同。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISAELISA，即，即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。別作

17、直接或間接法。 一個(gè)斑點(diǎn)一個(gè)斑點(diǎn)(bndin)(bndin)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)斑點(diǎn)(bndin)(bndin)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)因子量相關(guān) 基基本本原原理理第二十一頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)ELISPOT第二十二頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)3 3、流式細(xì)胞分析法、流式細(xì)胞分析法 流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)

18、胞因子和細(xì)胞表面粘附分子分子(fnz)(fnz)的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進(jìn)行的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子胞因子和膜分子(fnz)(fnz)的表達(dá)情況。的表達(dá)情況。 1 1分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞 2 2細(xì)胞固定細(xì)胞固定(gdng)(gdng) 3 3封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 4 4染色與分析染色與分析 基本基本(jbn)步驟步驟第二十三頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)細(xì)胞細(xì)胞(xbo

19、)內(nèi)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞(xbo)因子檢測技術(shù)因子檢測技術(shù)激活(j hu)膜抗原(kngyun)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記第二十四頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)使用使用(shyng)(shyng)流式細(xì)胞分析法，可以：流式細(xì)胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群： Th1Th1細(xì)胞細(xì)胞 IFN-IFN- Th2 Th2細(xì)胞細(xì)胞 IL-4IL-4細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體：細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體： 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù) 直接或間接熒光抗體染色直接或間接熒光抗體染色 無需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合無需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合(jih)(jih)位點(diǎn)的封閉位

20、點(diǎn)的封閉 待測細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)待測細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)第二十五頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)免疫學(xué)測定方法學(xué)評(píng)價(jià)免疫學(xué)測定方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)(pngji)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 特異性高特異性高 操作簡便、快速，無需依賴細(xì)胞株操作簡便、快速，無需依賴細(xì)胞株 影響因素較少且易控制影響因素較少且易控制(kngzh)(kngzh)，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 所測定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一所測定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比定呈正比 結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系結(jié)果

21、與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系 敏感性相對(duì)較低敏感性相對(duì)較低 標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合子的結(jié)合第二十六頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù)（三）分子生物學(xué)檢測（三）分子生物學(xué)檢測(jin c) 此方法測定此方法測定(cdng)的并非細(xì)胞因子本身，而是細(xì)胞的并非細(xì)胞因子本身，而是細(xì)胞因子的基因。因子的基因。方法：方法： 1、Northern印跡雜交法印跡雜交法 2、Southern 印跡雜交法印跡雜交法 3、PCR與逆轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄PCR 4、原位雜交，原位、原位雜交，原位PCR和原位和原位RTPCR 第二十七頁，共三十三頁。細(xì)胞因子檢測技術(shù) 三、常用三、常用