生物信息學(xué)講義——蛋白質(zhì)組學(xué)

1、Protein Analysis And Proteomics主要內(nèi)容主要內(nèi)容第一節(jié) 引言第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析方法第三節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲取與分析 蛋白質(zhì)組(proteome) 源于蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個(gè)字的結(jié)合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)，是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式作為研究對象，注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境（分子）的關(guān)系。 第一節(jié)第一節(jié) 引引 言言蛋白質(zhì)組學(xué)研究的策略蛋白質(zhì)組學(xué)研究的策略： 蛋白質(zhì)組學(xué)研究試圖比較細(xì)胞在不同生理

2、或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類和鑒定，并分析蛋白質(zhì)間的相互作用和功能。 一種稱為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)。 1.另一種策略稱為“功能法”，即研究不同時(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標(biāo)。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍： 一種是“完全”蛋白質(zhì)組學(xué)或表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(expression proteomics)，主要分析構(gòu)成蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量，并以此來探討細(xì)胞、組織、個(gè)體或特定狀態(tài)的特征。 另一種是“差異”蛋白質(zhì)組學(xué)或功能蛋白質(zhì)組學(xué)，主要篩選和鑒定

3、不同種類或狀態(tài)下各樣品間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化，通過分析蛋白質(zhì)組中構(gòu)成蛋白質(zhì)間相互作用及細(xì)胞內(nèi)功能單位，解析蛋白質(zhì)組與細(xì)胞功能之間的相關(guān)性。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)（functional proteomics）” 研究細(xì)胞或個(gè)體在某一特定時(shí)間所表達(dá)或與某個(gè)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)集合體。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在細(xì)胞和生命有機(jī)體的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律。功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可為食品改造、疫苗開發(fā)和生物制藥等提供重要依據(jù)。 功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)已成為后基因組的重要組成部分。 主要研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容： 蛋白質(zhì)組的組成成分，即蛋白質(zhì)組的表達(dá)模式(expr

4、ession profile) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾1.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用一、 蛋白質(zhì)的指紋特征二、蛋白質(zhì)的定位、修飾三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析方法蛋白質(zhì)分析方法一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征 蛋白質(zhì)的指紋即肽質(zhì)量指紋譜具有特征性 由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)）都不同，蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點(diǎn)的蛋白酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具有特征性，稱為肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF），即蛋白質(zhì)的指紋特征。一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征2. 肽質(zhì)量指紋譜是鑒定蛋白質(zhì)的常用參數(shù) 質(zhì)譜

5、指紋分析需要經(jīng)過蛋白質(zhì)原位酶解（包括蛋白質(zhì)凝膠的脫色、還原和烷基化、酶解、萃取及合并萃取液凍干后進(jìn)行質(zhì)譜分析）、MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋圖測定（包括蛋白樣品脫鹽及制備、質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖測定）及蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫搜尋等三個(gè)步驟。 一、蛋白質(zhì)的指紋特征一、蛋白質(zhì)的指紋特征3. 肽質(zhì)量指紋譜可用作其他測定參數(shù) 測定不同物種間的保留特性，從而推斷分子的功能。由生物多樣性和進(jìn)化上遠(yuǎn)離引起的氨基酸殘基取代，顯示了蛋白中的特征功能區(qū)。 在一個(gè)蛋白消解物中，用來檢測在化學(xué)或酶處理前后的“非匹配”（即和預(yù)測片段不符）的肽，從而表征蛋白的修飾。二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾 蛋白質(zhì)功能模式的

6、研究是蛋白質(zhì)組研究的最終目標(biāo)，其主要研究目標(biāo)是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。 蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)翻譯后修飾及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用都是目前其研究的重要內(nèi)容。蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位1. 蛋白質(zhì)的定位基于十二類亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位主要基于12類亞細(xì)胞的分類數(shù)據(jù)庫（來自SwissProt）： 細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、細(xì)胞骨架、液泡、細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)。二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾2. 蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位有兩種機(jī)制

7、 翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)（post-translational translocation） 共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)（co-translational translocation） 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位3. 生物信息學(xué)預(yù)測亞細(xì)胞定位 構(gòu)建可靠的數(shù)據(jù)庫，對蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析與預(yù)測，能加速蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究。 l 綜合數(shù)據(jù)庫（SwissProt、MIPS等） l 模式生物數(shù)據(jù)庫 l 專門的亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位4. 蛋白質(zhì)信息的提取是亞細(xì)胞定位預(yù)測的基本步驟 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、

8、修飾l 蛋白質(zhì)分選信號 l 蛋白質(zhì)序列的氨基酸組分 l 蛋白質(zhì)的功能域信息 l 序列比對信息 l GO注釋信息 l 氨基酸物理化學(xué)性質(zhì) l 混合性特征參數(shù) 蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)的定位 蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），即是指蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯后會在個(gè)別氨基酸鏈上共價(jià)結(jié)合各種非肽類基團(tuán)，形成翻譯后修飾。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾在體內(nèi)是一個(gè)動態(tài)的變化過程，有效探明細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)修飾譜的“翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)”成為當(dāng)今功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾1. 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋

9、白質(zhì)行使正常生理功能所必需的 蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一。 常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型：磷酸化、糖基化、甲基化、泛素化、脂基化等。二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾2. 質(zhì)譜是鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方法 蛋白質(zhì)翻譯后的修飾的解析主要采用電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）兩種質(zhì)譜技術(shù)。 質(zhì)譜主要通過質(zhì)量偏移（mass shift）來識別翻譯后修飾蛋白。3. 基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定翻譯后修飾的結(jié)果分析采用數(shù)據(jù)庫搜索法 由質(zhì)譜數(shù)

10、據(jù)鑒定翻譯后修飾肽段的主要方法分為兩大類：數(shù)據(jù)庫搜索法（database searching）和從頭測序法（DeNovo sequencing）。 常用的數(shù)據(jù)庫搜索法有SEQUEST、Mascot、X!Tandem、MS-Align等。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾4. 生物信息學(xué)預(yù)測和鑒定方法有助于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究 生物信息方法的介入，能夠從序列和質(zhì)譜兩個(gè)角度幫助大規(guī)模鑒定翻譯后修飾，有助于翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的迅速發(fā)展。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾5. 基于序列法是預(yù)測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要生物信息

11、學(xué)方法 同類翻譯后修飾位點(diǎn)周圍的片段往往都具有很強(qiáng)的序列保守性，通過對常見翻譯后修飾的數(shù)據(jù)的收集，及對發(fā)生同類修飾的蛋白序列特征的研究如保守motif，從而能夠基于序列預(yù)測翻譯后修飾。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的修飾1. 蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動的基礎(chǔ) 生命的基本過程就是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用的結(jié)果。 細(xì)胞各種重要的生理過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞對外界環(huán)境及內(nèi)環(huán)境變化的反應(yīng)等，都是以蛋白之間相互作用為紐帶，并形成網(wǎng)絡(luò)。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用2. 蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)蛋白質(zhì)-

12、蛋白質(zhì)間相互作用的基礎(chǔ) 典型蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域是一個(gè)具有結(jié)合專一性的獨(dú)立折疊元件，可以插入新的蛋白質(zhì)中并保留結(jié)合靶部位的能力。 它們的相互作用多是通過 2個(gè)多肽表面幾何構(gòu)型和靜電力而相互連接。二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用3. 實(shí)驗(yàn)方法是鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用的主要方法 酵母雙雜交系統(tǒng) 噬菌體表面展示技術(shù) 蛋白質(zhì)親和色譜 表面等離子共振技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 免疫共沉淀技術(shù) Pull-down技術(shù) 親和印跡 化學(xué)交聯(lián)技術(shù) 蛋白質(zhì)探針技術(shù)

13、 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用4. 生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)相互作用研究的有力工具，蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫是預(yù)測蛋白質(zhì)間相互作用的基礎(chǔ) 使用最廣泛、數(shù)據(jù)信息最完善的人類相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用公共數(shù)據(jù)庫有：BIND, DIP, IntAct, HPRD, MINT, MIPS二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用5. 預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的生物信息學(xué)算法 基于基因組信息的預(yù)測方法 基于進(jìn)化信息的方法 基于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的從頭預(yù)測方法 需要三維結(jié)構(gòu)信息的方法 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)

14、的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用6. 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是研究蛋白質(zhì)相互作用的最終目標(biāo) 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)可以顯示蛋白質(zhì)從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的一系列變化過程，揭示參與該過程的一系列生物學(xué)事件和作用因子，提示某一過程的中斷或變化可能導(dǎo)致的生物學(xué)后果等。 二、蛋白質(zhì)的定位、修飾二、蛋白質(zhì)的定位、修飾蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)的相互作用 蛋白質(zhì)的分析通常是指對未知或已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的預(yù)測與解析。 對蛋白質(zhì)的分析基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的信息。 與蛋白質(zhì)分析有關(guān)的主要有蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫等一次（級）數(shù)據(jù)庫，及構(gòu)建而成的具有特殊生物學(xué)意義和專門用途的蛋白質(zhì)二次（級）數(shù)據(jù)庫

15、。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（一）蛋白質(zhì)物理特性的預(yù)測基于蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列 從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，可以預(yù)測出蛋白質(zhì)的許多物理性質(zhì)，包括等電點(diǎn)、分子量、酶切特性、疏水性、電荷分布等。 相關(guān)工具有：Compute pI/Mw，PeptideMass，TGREASE，SAPS等。三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（二）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以已知三維結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為依據(jù) 二級結(jié)構(gòu)是指螺旋和折疊等規(guī)則的蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)元件。不同的氨基酸殘基對于形成不同的二級結(jié)構(gòu)元件具有不同的傾向性，這構(gòu)成了進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的基礎(chǔ)。 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測常用方法有：nnPred

16、ict，PredictProtein，SOPMA，COILS，TMpred，SignalP等。三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（三）蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測是最復(fù)雜和最困難的預(yù)測技術(shù) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測最終是要從蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測出其三維空間結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)的折疊過程仍然不十分明了，從理論上解決蛋白質(zhì)折疊的問題仍較困難。 有一定作用的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法最常見的是“同源模建”和“Threading”方法。三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（四）蛋白質(zhì)功能預(yù)測主要根據(jù)序列預(yù)測功能 思路及一般流程為： 通過相似序列的數(shù)據(jù)庫比對確定功能。 確定序列特性，如疏水性、跨膜螺旋

17、和前導(dǎo)序列等。 通過序列模體數(shù)據(jù)庫等的比對確定功能，查未知序列是否包含保守序列模體。 查對搜索Prosite等數(shù)據(jù)庫最終預(yù)測蛋白質(zhì)功能。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（五）蛋白質(zhì)分析有很多其他非在線軟件包工具 除了在線分析工具之外，尚有很多非在線的蛋白質(zhì)分析軟件包工具得以開發(fā) 如：AnthePro ，PSAAM，VHMPT，MPEx等。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（六）常用蛋白質(zhì)一次序列數(shù)據(jù)庫有PIR、SwissProt、NRL-3D、TrEMBL、GenPept等（七）蛋白質(zhì)二次序列數(shù)據(jù)庫是由一級序列數(shù)據(jù)庫整合而來的復(fù)合數(shù)據(jù)庫 將一次數(shù)據(jù)庫整

18、合起來構(gòu)建成復(fù)合數(shù)據(jù)庫或二次數(shù)據(jù)庫，更有利于生物學(xué)家的使用。蛋白質(zhì)序列二次數(shù)據(jù)庫主要有：Prosite，OWL，NRDB等。三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（八）蛋白質(zhì)一次結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫有PDB、SCOP、CATH等 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫是生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的主要組成部分，是隨X射線晶體衍射分子結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的出現(xiàn)而出現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫，其基本內(nèi)容為實(shí)驗(yàn)測定的蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)原子坐標(biāo)。 三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（九）蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 如：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象參數(shù)數(shù)據(jù)庫（DSSP）、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫（FSSP）、同源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（HSSP） 等。 三、蛋白

19、質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫三、蛋白質(zhì)分析軟件與數(shù)據(jù)庫第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的獲取與分析取與分析一、二維凝膠電泳分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)四、酵母雙雜交系統(tǒng)五、Rosentta Stone方法 六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫 一、二維凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù)二維凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高、信息最多的技術(shù) （一）二維凝膠電泳技術(shù)的定義及特點(diǎn) 第一向是等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點(diǎn)。 第二

20、向是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量的分離。 固相pH梯度-SDS雙向凝膠電泳 (IPG-DALT電泳)是目前最常用的2DE技術(shù)。一、二維凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù)（二）IPG-DALT電泳是目前分辨率最高的電泳方法 1. 樣品制備 2. 蛋白質(zhì)定量 3. 一向電泳 4. 一向膠條的平衡 5. 二向電泳 6. 凝膠檢測 一、二維凝膠電泳分析技術(shù)一、二維凝膠電泳分析技術(shù) 質(zhì)譜分析法是按照離子的質(zhì)荷比（m/z）大小對離子進(jìn)行分離和測定從而對樣品進(jìn)行定性和定量分析的一種方法。 自20世紀(jì)初產(chǎn)生起，質(zhì)譜已成為連接蛋白質(zhì)與基因的重要技術(shù)，是蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最

21、快，也最具活力和潛力的技術(shù) 。 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)（一）質(zhì)譜儀是質(zhì)譜分析技術(shù)的重要科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器 質(zhì)譜儀(mass spectrometer, MS)是利用電磁學(xué)原理使離子按照質(zhì)荷比進(jìn)行分離，從而測定物質(zhì)的質(zhì)量與含量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器，一般由進(jìn)樣器、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成，其中樣品入機(jī)的離子化源和測量被介入離子分子量的質(zhì)量分析器是兩個(gè)關(guān)鍵的部件。 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)（二）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽分析中的應(yīng)用 1. 分子量測定 2. 肽譜測定 3. 肽序列測定 4. 巰基和二硫鍵定位 5. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾 二

22、、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)（三）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析技術(shù) MALDI-TOF MS為脈沖式的離子化技術(shù)，從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測其分子量，特點(diǎn)是對鹽和添加物的耐受力高，樣品測量速度快，且操作簡單。l MALDI-TOF質(zhì)譜測定肽質(zhì)量指紋圖 l MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)用于蛋白質(zhì)C-端序列分析 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)（四 ）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）分析 ESI-MS采用連續(xù)離子化的方法，從液相中產(chǎn)生離子，能快速、準(zhǔn)確地解決從小分子到生物大分子或不穩(wěn)定有機(jī)分子質(zhì)量的測定問題，常作為與其他分析技

23、術(shù)聯(lián)用的首選儀器 。l 電噴霧電離質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)和多其他子質(zhì)量 l 液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法鑒定2DE蛋白質(zhì) 二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)二、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析技術(shù)（五）串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）串聯(lián)質(zhì)譜法可選擇性分析混合物中的某個(gè)組分而不必將各組分分開。第一級質(zhì)量分析器獲得所有組分的分子離子峰（母離子），經(jīng)質(zhì)量過濾器挑出需進(jìn)一步分析的母離子，此母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)高流速惰性氣體碰撞誘導(dǎo)離解（CID）產(chǎn)生碎片離子（子離子），子離子進(jìn)入第二級質(zhì)量分析器獲得母離子的碎片峰。通過研究母離子和子離子的裂解關(guān)系，可以獲得多肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。（一）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種

24、高通量的、小型化的、平行性的生物檢測技術(shù) 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) 為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中除了酵母雙雜交、雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等之外的一種重要的工具。 （二）蛋白質(zhì)芯片的基本原理與特點(diǎn) 蛋白質(zhì)芯片包括固定有保持天然活性的蛋白質(zhì)、能與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA和RNA、糖類、合成多肽及其他能夠從復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中特異性地捕獲目的蛋白的小分子物質(zhì)的微陣列。 特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、敏感性高、通量高、重復(fù)性好、應(yīng)用性強(qiáng)、適用范圍廣。三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)（三）蛋白質(zhì)芯片的分類1. 功能：功能研究型芯片和分析檢測型芯片。 2. 固定在芯片上的蛋白質(zhì)種類：抗體芯片和抗原芯片

25、。 3. 芯片表面的化學(xué)成分：化學(xué)表面芯片和生物表面芯片。 4. 點(diǎn)樣蛋白質(zhì)有無活性功能：無活性和有活性芯片。 5. 載體：普通玻璃載體芯片、多孔凝膠覆蓋芯片、微孔芯片等。三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)（四）蛋白質(zhì)芯片的制備及分析1. 被測物質(zhì)的準(zhǔn)備 2. 反應(yīng)過程 3. 芯片的檢測 4. 結(jié)果的分析 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)（五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)應(yīng)用廣泛1. 基因表達(dá)的篩選 2. 特異性抗原抗體的檢測 3. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 4. 蛋白質(zhì)相互作用的研究 三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)三、蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)

26、是一種直接于酵母細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而且靈敏度很高的分子生物學(xué)方法。 酵母雙雜交系統(tǒng)是鑒定及分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的最常用及最有效的工具之一，此技術(shù)現(xiàn)已逐漸推廣到了如信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控及基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)研究領(lǐng)域。 四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng)（一）酵母雙雜交系統(tǒng)原理l 上游激活序列(UAS) l 氨基(N)端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD) l 羧基(C)端 的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD) l “誘餌”蛋白X l “獵物”蛋白Y 四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng)人民衛(wèi)生出版社8年制及7年制臨床醫(yī)學(xué)等專業(yè)用生物信息學(xué)（二）酵母雙雜交系統(tǒng)特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)l 實(shí)現(xiàn)了真正的克

27、隆基因目標(biāo)化 ；l 在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行并完成的，反映了蛋白在體內(nèi)的交互作用；l 可以高靈敏度地檢測蛋白與蛋白之間的交互作用 。四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng)（三）酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性及優(yōu)化l 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低（酵母交配技術(shù)）； l 雜交過程在細(xì)胞核內(nèi)完成，不便于研究膜蛋白、分泌蛋白、膜受體及胞質(zhì)蛋白（分離的泛素系統(tǒng)）；l 結(jié)果假陽性、假陰性較高（雙篩選系統(tǒng)、三篩選系統(tǒng)）。四、酵母雙雜交系統(tǒng)四、酵母雙雜交系統(tǒng) Rosetta Stone方法即是近年來開發(fā)出的基于基因組”上下文”的方法來預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，用于研究非同源基因之間功能關(guān)朕的方法。 五、五、Rosentta Stone方法方法 羅

28、塞塔石碑(Rosetta Stone)是1799年在埃及羅塞塔發(fā)掘出的刻有古埃及文字及希臘文的石碑 。 三種文字相互對照，就可以知道一個(gè)個(gè)古埃及象形文字所代表的含義。 （一）Rosetta Stone方法的來源 羅塞塔石碑(Rosetta Stone)：石碑上用三種文字書寫同一段話，對同一內(nèi)容文字進(jìn)行互譯。 羅塞塔石碑方法(Rosetta Stone method)：又稱為基因融合法(gene fusion method)。 五、五、Rosentta Stone方法方法（二）Rosetta Stone方法的基本分析步驟1. 建立一個(gè)輸入文件，里面包括待查蛋白質(zhì)序列； 2. 建立一個(gè)可供BLAS

29、T搜索的數(shù)據(jù)庫，并對序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行格式化； 3. 運(yùn)行本地BLAST進(jìn)行分析，并對BLAST出來的結(jié)果進(jìn)行分析；4. 識別Rosetta Stone序列及預(yù)測蛋白間的功能關(guān)聯(lián)。 五、五、Rosentta Stone方法方法（三）Rosetta Stone方法的應(yīng)用l 潛力大：利用Rosetta Stone方法，在大腸桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一共有6,809種潛在的蛋白質(zhì)間相互作用，而在酵母中共有45,502種。l 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：有效的研究蛋白質(zhì)間相互作用的高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 。 五、五、Rosentta Stone方法方法 數(shù)據(jù)庫技術(shù)和相關(guān)的分析軟件, 是蛋白質(zhì)組的研究不可缺少的信息學(xué)手段, 可用于這些數(shù)據(jù)的存儲、管理與分析。 六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫六、蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件與數(shù)據(jù)庫（一）常用的蛋白質(zhì)組分析工具1. 蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖數(shù)據(jù)庫2. 蛋白質(zhì)組圖譜