洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察

1、LOGO洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞骨架的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握植物細(xì)胞骨架顯示的原理及染色方法、掌握植物細(xì)胞骨架顯示的原理及染色方法. 2、觀察光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、觀察光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是指真核細(xì)胞中的纖維蛋白所組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。、細(xì)胞骨架的概念紅：微絲紅：微絲 綠：微管綠：微管微管微管主要成分微管蛋白微管主要分布在核周圍， 呈放射狀向四周擴(kuò)散 電鏡下的微管1.微管蛋白微管蛋白（一）微管的化學(xué)組成（一）微管的化學(xué)組成微微管管蛋蛋白白 微管蛋白微管蛋白 微管蛋白微管蛋白異二異二聚體聚體

2、2個(gè)鳥嘌呤核苷酸個(gè)鳥嘌呤核苷酸（GTP)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)?？膳c秋水仙素、長春可與秋水仙素、長春花堿結(jié)合?；▔A結(jié)合。 微管蛋白微管蛋白 微管蛋白微管蛋白異二異二聚體聚體聚合聚合首位首位相連相連原纖維原纖維微管微管（13） 微絲的形態(tài)與組分微絲的形態(tài)與組分 形態(tài)：形態(tài)：是一類由蛋白纖維組成的實(shí)心纖維細(xì)是一類由蛋白纖維組成的實(shí)心纖維細(xì)絲。絲。直徑直徑 5-7nm，長短不一。，長短不一。 在細(xì)胞中，微絲可在細(xì)胞中，微絲可成束、成網(wǎng)或纖維狀分散分布成束、成網(wǎng)或纖維狀分散分布，主要分布與細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)。 在具有運(yùn)動(dòng)功能的細(xì)胞中比較發(fā)達(dá)。在具有運(yùn)動(dòng)功能的細(xì)胞中比較發(fā)達(dá)。 微絲微絲化學(xué)成分化學(xué)成分肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)

3、蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白 中間絲中間絲 直徑介與微管與微絲之間，故得名中間絲直徑介與微管與微絲之間，故得名中間絲（中間纖維（中間纖維 IF） 810nm。中間纖維則分布在整個(gè)細(xì)胞中。 IF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定：既不受秋水仙素也不受細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定：既不受秋水仙素也不受細(xì)胞松弛松弛B素影響，并且也沒有極性。素影響，并且也沒有極性。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架細(xì)胞生長、細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)維持細(xì)胞形態(tài)維持細(xì)胞形態(tài)分裂分裂、分化分化 基因表達(dá)基因表達(dá)能量轉(zhuǎn)換能量轉(zhuǎn)換信息傳遞信息傳遞物質(zhì)運(yùn)輸物質(zhì)運(yùn)輸細(xì)胞骨架的功能細(xì)胞骨架的功能微管微管微絲微絲中間絲中間絲 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞骨架組成及

4、分類細(xì)胞骨架組成及分類根據(jù)組根據(jù)組成成分成成分及形態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)細(xì)胞質(zhì)骨架細(xì)胞質(zhì)骨架細(xì)胞骨架細(xì)胞骨架細(xì)胞膜骨架細(xì)胞膜骨架細(xì)胞核骨架細(xì)胞核骨架細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)骨架細(xì)胞質(zhì)骨架廣義廣義狹義狹義二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞骨架觀察方法細(xì)胞骨架觀察方法 電鏡電鏡組織化學(xué)組織化學(xué)間接免疫熒光間接免疫熒光 酶標(biāo)酶標(biāo)觀察方法觀察方法二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 試劑選用原因試劑選用原因1Triton X-100可可溶解抽提細(xì)胞中溶解抽提細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，但不破壞細(xì)胞骨但不破壞細(xì)胞骨架系統(tǒng)，因此顯架系統(tǒng)，因此顯得更清晰得更清晰3M-緩沖液緩沖液洗滌洗滌細(xì)胞，可以提高細(xì)胞，可以提高骨

5、架穩(wěn)定性骨架穩(wěn)定性2戊二醛戊二醛固定能較固定能較好保存骨架成分、好保存骨架成分、考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250染色，使骨架蛋染色，使骨架蛋白著色，胞質(zhì)背白著色，胞質(zhì)背景著色弱，有利景著色弱，有利于骨架顯示于骨架顯示 注意微絲微管和中間絲都是直徑很小的結(jié)構(gòu)，最大的單根微絲微管和中間絲都是直徑很小的結(jié)構(gòu)，最大的單根微管才微管才25nm左右，只能在電鏡下觀察。左右，只能在電鏡下觀察。 本實(shí)驗(yàn)用普通光鏡是本實(shí)驗(yàn)用普通光鏡是因?yàn)楣羌芾w維成束分布，染色后有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)抽提因?yàn)楣羌芾w維成束分布，染色后有夸大作用。由于細(xì)胞經(jīng)抽提后剩下的主要是細(xì)胞骨架，使之顯現(xiàn)更清晰。后剩下的主要是細(xì)胞骨架，使之顯現(xiàn)更清

6、晰。M緩沖液緩沖液 M緩沖液使細(xì)胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑EGTA 和EDTA螯合 Ca離子，溶液并提供Mg離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚) 是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）。分子量為646.86（C34H62O11）。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。非離子型表面活性劑它在水溶液中不產(chǎn)生離子的一種表面活性劑。它在水中的溶解是由于它具有對(duì)水親和力很強(qiáng)的官能團(tuán)。表面活性劑表面活性劑分子結(jié)構(gòu)具有兩親性： 一端為親水基團(tuán)，另一端為疏水 基團(tuán)。溶解于水中以后，表面活 性劑能降低水的表

7、面張力，并提 高有機(jī)化合物的可溶性?？捡R斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。其中考馬斯亮藍(lán)G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來作為蛋白質(zhì)含量的測定。3%-戊二醛戊二醛 作為一種有機(jī)交聯(lián)劑 戊二醛在一定條件下能將單體、線型高分子或預(yù)聚物轉(zhuǎn)變成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。 戊二醛在1%濃度時(shí)，交聯(lián)度已達(dá)到很高的程度，在此濃度以下，隨濃度下降，交聯(lián)度下降，溶脹度和降解率增加。濃度超過1%時(shí)，各指標(biāo)無明顯變化。 交聯(lián)劑是一種能在線型分子間起架橋作用，從而使多個(gè)線型分子相互鍵合交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。促進(jìn)或調(diào)節(jié)聚合物分子鏈間共價(jià)鍵或離子鍵形成的物質(zhì)。三、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)用

8、品1、材料、材料2、器材、器材3、試劑、試劑洋洋蔥蔥鱗鱗莖莖顯微鏡、小顯微鏡、小燒杯、滴管、燒杯、滴管、載玻片、蓋載玻片、蓋玻片、鑷子玻片、鑷子 M-緩沖液緩沖液 6mmol/L磷酸緩沖磷酸緩沖液液 1% Triton X-100 0.2%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán) R250 3%戊二醛戊二醛3.0%3.0%戊二醛：用戊二醛：用0.2mol/L0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制磷酸鹽緩沖液配制 0.2考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250：甲醇：甲醇46.5ml，冰乙酸，冰乙酸7ml，蒸餾水，蒸餾水46.5ml三、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)用品 4 4、試劑配制、試劑配制1% Triton X-100：一般配成：一般配成

9、30%儲(chǔ)備液，通儲(chǔ)備液，通 常常Triton X-100與與M-緩沖液以所需比例混合置于緩沖液以所需比例混合置于30-40 水浴水浴2-3小時(shí)，以便液體充分混勻。使小時(shí)，以便液體充分混勻。使用時(shí)將用時(shí)將30%儲(chǔ)備液臨時(shí)稀釋成儲(chǔ)備液臨時(shí)稀釋成1%。 M-緩沖液四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法1、撕取、撕取2、抽提、抽提3、沖洗、沖洗4、固定、固定吸去緩沖液，用吸去緩沖液，用1%TritonX-100 處理洋蔥處理洋蔥表皮表皮25 min。3戊二醛固定戊二醛固定30min撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞約撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞約1cm2大小若大小若干片，置于磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中，使其干片，置于磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中，使其下沉，（下沉，（12min)吸去吸去Triton Xl00，用，用M一緩沖液洗一緩沖液洗3次，次，每次每次5分鐘分鐘四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法5、沖洗、沖洗6、染色、染色7、制片、制片8、觀察、觀察PH6.8磷酸磷酸緩沖液洗緩沖液洗3次，每次次，每次5分鐘分鐘用用