農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)研究課題-副本

1、基于麥長管蚜的海藻糖酶抑制劑的合理設(shè)計(jì)與篩選研究摘要隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的進(jìn)步，人工合成有機(jī)殺蟲劑來防治病蟲害已成為提高農(nóng)作物產(chǎn)量的主要手段之一。為解決傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑所帶來的毒性殘留、害蟲抗藥性等負(fù)面問題，新型無公害綠色農(nóng)藥的研發(fā)已成為重要的研究領(lǐng)域，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，特別是化學(xué)信息學(xué)的出現(xiàn)和農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)的應(yīng)用，為這一研究提供了前所未有的機(jī)遇。近年來，針對昆蟲生理過程中特有的一些能源物質(zhì)如海藻糖、幾丁質(zhì)、生長激素等，來確定新的藥物作用靶點(diǎn)，已成為農(nóng)藥研發(fā)的新途徑。分布在中國各產(chǎn)麥區(qū)。麥長管蚜寄主于小麥、大麥、燕麥，前期集中在葉正面或背面，后期集中在穗上刺吸汁液，致受害株生長緩慢，分蘗減少，千粒重下

2、降，是麥類作物重要害蟲。也是麥蚜中的優(yōu)勢種。本文旨在提出以害蟲麥長管蚜為對象，利用計(jì)算機(jī)輔助的合理設(shè)計(jì)和篩選一種海藻糖酶抑制劑。關(guān)鍵詞：海藻糖酶抑制劑 計(jì)算機(jī)輔助 農(nóng)藥分子設(shè)計(jì) 靶標(biāo) 先導(dǎo)化合物第一章 文獻(xiàn)綜述1.1引言昆蟲是地球上種類最為繁盛的一個類群,昆蟲的血糖,它不同于哺乳動物體內(nèi)的葡萄糖和植物中的蔗糖而是選擇了海藻糖作為其血糖。海藻糖的性質(zhì)非常穩(wěn)定,能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下在細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜,有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞,從而能有效維持生命體的生命過程和生物特征。而在自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類,均不具備這一功能。對許多生命體而言,海藻糖的有與無,意味著生

3、存或者死亡1。海藻糖,廣泛存在于低等植物、藻類、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲及其它無脊椎動物中,既是一種貯藏性糖類,又是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物。因此，以海藻糖為靶標(biāo)的除蟲劑對人和動物是十分安全的。昆蟲飛行是一個極大的耗能過程。有研究表明,在飛行的起始半個小時(shí),主要消耗的是碳水化合物海藻糖,而在昆蟲持續(xù)飛行的過程中血淋巴中脂肪的含量會隨飛行時(shí)間的增加而明顯降低。這種特殊的能量代謝途徑的存在,為昆蟲飛行抑制劑的研發(fā)提供了思路2。近年的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)validamycin A (VLA),t-rehazolin，salbostatin等篩選于微生物體內(nèi)的小分子化合物，可以抑制昆蟲體內(nèi)海藻糖的水解過程。通過抑制海

4、藻糖水解為葡萄糖，從而引發(fā)昆蟲“低血糖癥”，己經(jīng)可以達(dá)到殺滅害蟲的效果。海藻糖合成酶的結(jié)構(gòu)已知，可以以此進(jìn)行基于受體的農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)，但由于海藻糖水解酶晶體結(jié)構(gòu)仍然未知,給海藻糖酶抑制劑的研究帶來困難。目前所研究的天然海藻糖酶抑制劑雖然具有較高的離體活性,但是難以進(jìn)入生物體內(nèi),難以作為生物農(nóng)藥推廣。以這些抑制劑為先導(dǎo)化合物,通過先導(dǎo)優(yōu)化、分子模仿等方法合成出一些具有相同或相近功效的新型殺蟲劑和殺菌劑將是開發(fā)海藻糖酶抑制劑類農(nóng)藥的主要方向3。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(Computer-aided drug design, CADD)方法的快速發(fā)展也是合理藥物設(shè)計(jì)取得重大突破的一個重要原因。CADD以計(jì)算

5、機(jī)技術(shù)為基礎(chǔ),利用理論模擬、計(jì)算和預(yù)測等手段分析配體小分子與受體大分子之間的相互作用機(jī)制,以此來指導(dǎo)新藥結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)過程。目前,許多國家的藥物研發(fā)者和制藥公司也將CADD技術(shù)作為藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的重要手段,且在該領(lǐng)域的研究成果也顯示了 CADD的巨大實(shí)用價(jià)值。1.2海藻糖酶的研究現(xiàn)狀1.2.1海藻糖酶的特性海藻糖水解酶，國際酶學(xué)編號為 ( EC:3.2.1.28) ，首先是 在1893年由Bourquelot在黑曲霉中發(fā)現(xiàn)的，廣泛存在于微生物、植物、昆蟲和哺乳動物中。海藻糖酶由海藻糖酶基因Trehalas編碼，以兩種不同形式存在于昆蟲組織中，一種是可溶型海藻糖酶Tre-1；另一種是膜結(jié)合型海藻糖酶

6、Tre-2。Tre-1是1992年最先在黃粉蟲Tenebrio molitor中被克隆出來的第一個由海藻糖酶基因編碼的海藻糖酶，主要存在于消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，在腸道、馬氏管、卵巢和唾液腺等部位表達(dá)。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蟬中腸可溶型海藻糖酶與卵巢膜結(jié)合型海藻糖酶來自同1個遺傳子；于彩虹4等 (2013) 研究發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟 O.furnacalis等幼蟲隨著日齡的增加，海藻糖酶活性呈現(xiàn)增加趨勢，不同昆蟲各組織海藻糖酶的活性有明顯差異；這項(xiàng)研究為我國開展農(nóng)業(yè)害蟲海藻糖酶方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Tre-2是2005年在家蠶Bombyx mori中獲得的第一個海藻糖酶基因編碼的海藻糖酶，主要存在于肌肉中。

7、在飛行肌肉相關(guān)組織、腸道、馬氏管、脂肪體、腦組織、卵巢和唾液腺中都有表達(dá)。該基因包含一個20個氨基酸的跨膜區(qū)域，而Tre-1 則不存在跨膜區(qū)。最近，陳靜等 (2013) 等利 用 同 源 克 隆 及RACE技術(shù)，從白背飛虱Sogatella furcifera、綠盲蝽Apolyguslucorum中克隆獲得膜結(jié)合型海藻糖酶基因，為研究其在昆蟲體內(nèi)的表達(dá)與生物學(xué)功能奠定了良好基礎(chǔ)。目前已在多種昆蟲中克隆獲得這兩種海藻糖酶基因，它們所編碼的蛋白具有2個“ 標(biāo) 簽 序 列” PGGRFREFYYWDSY和QWDYPNAW PP及一個甘氨酸富集區(qū) (GGGGEY)5海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)重要的糖酶，存在于

8、昆蟲幾乎所有的組織中，海藻糖酶把 1 分子的海藻糖水解為2分子的葡萄糖，用于組織細(xì)胞的糖酵解，為各組織器官提供能量，使昆蟲的各項(xiàng)生命活動得以維持和發(fā)展。1.2.2海藻糖酶在昆蟲中的作用1.2.2.1 海藻糖酶對昆蟲能量代謝的調(diào)控作用早在20世紀(jì)60年代，張清剛 (1964)6 在研究蓖麻蠶變態(tài)期間代謝作用時(shí)就發(fā)現(xiàn)血淋巴和脂肪體中糖代謝與海藻糖酶活力變化之間存在一定的聯(lián)系。近年來很多研究表明大量昆蟲飛行、肌肉劇烈運(yùn)動所需的能量由能源物質(zhì)海藻糖和糖原代謝產(chǎn)生，當(dāng)海藻糖酶活性受到抑制時(shí)，海藻糖酶催化海藻糖分解的過程也會受到抑制，昆蟲的各種能量供應(yīng)及血糖的濃度都會受到制約。還有研究表明一些殺蟲劑亞致死

9、劑量能夠增強(qiáng)褐飛虱體內(nèi)海藻糖酶活性，有效促進(jìn)海藻糖的降解。相反，岡霉亞基胺A井岡霉素A及海藻唑啉 (Trehalose)等能夠有效抑制海藻糖 酶的活性，致使以海藻糖為能源物質(zhì)的能量供應(yīng)受到抑制。1.2.2.2海藻糖酶在昆蟲幾丁質(zhì)合成中的調(diào)控作用海藻糖酶還能抑制昆蟲幾丁質(zhì)的合成，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育。Tre-1 對于昆蟲表皮中幾丁質(zhì)的合成、碳水化合物的攝取以及體內(nèi)營養(yǎng)的動態(tài)平衡具有重要意義，對昆蟲表皮的幾丁質(zhì)合成影響更大；Tre-2則主要影響中腸的幾丁質(zhì)合成以及生長發(fā)育過程。 Chen7等揭示了兩種不同類型海藻糖酶對甜菜夜蛾生長發(fā)育過程中幾丁質(zhì)合成功能的影響，當(dāng)用 Tre-1 的 RNA感染片

10、段干擾后，昆蟲幾丁質(zhì)合成酶A基因的表達(dá)和幼蟲表皮幾丁質(zhì)的含量受到顯著影響，表現(xiàn)為影響甜菜夜蛾幼蟲到蛹的蛻皮變態(tài)；而Tre-2則在蛹到成蟲的發(fā)育階段中具有重要作用，主要表現(xiàn)為影響幾丁質(zhì)合成酶B基因的表達(dá)和幼蟲中腸幾丁質(zhì)含量。魏蘋 8對赤擬谷盜Tribolium castaneum的5個海藻糖酶基因進(jìn)行單個基因的RNA干擾后，發(fā)現(xiàn)大量基因表達(dá)下降，TcTre1-1 通過調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)的合成通路對其生長進(jìn)行調(diào)控，其他4個基因都是通過調(diào)節(jié)能量通路對其發(fā)揮作用。由此可見，海藻糖酶是昆蟲表皮幾丁質(zhì)合成通路中一個重要的酶。1.2.2.3 海藻糖酶在昆蟲滯育中的作用海藻糖酶是昆蟲滯育激素調(diào)控代謝過程中的關(guān)鍵酶，昆

11、蟲滯育期間海藻糖酶活性的下降保證了海藻糖在昆蟲體內(nèi)的累積，使其安全度過滯育期的不良環(huán)境。家蠶海藻糖酶基因是一種非組織特異性表達(dá)基因，可以在卵巢、中腸、馬氏管和脂肪體等多種組織中表達(dá)，其表達(dá)受滯育激素(DH) 的誘導(dǎo)調(diào)控，DH通過心側(cè)體、咽側(cè)體釋放到血淋巴中，誘導(dǎo)卵巢中海藻糖酶基因的表達(dá)，家蠶卵母細(xì)胞通過位于膜內(nèi)的海藻糖酶，將血液中海藻糖降解成葡萄糖，然后吸收到細(xì)胞內(nèi)，最后合成糖原，從而誘導(dǎo)蠶卵滯育，而在其他組織中滯育激素對海藻糖酶的活性沒有影響。隨后，種種研究都表明，海藻糖酶對昆蟲的滯育過程具有重要的作用9。此外，海藻糖酶活性受抑制后，會影響昆蟲生殖腺和生殖細(xì)胞的發(fā)育，因此昆蟲的生殖能力也會被

12、抑制，還會導(dǎo)致昆蟲變態(tài)時(shí)的異常；研究還發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)家蠶膜結(jié)合型海藻糖酶的活性能夠有效促進(jìn)滯育激素誘導(dǎo)卵巢產(chǎn)生滯育卵，利于提高抗寒性。1.3海藻糖酶抑制劑研究進(jìn)展 隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的進(jìn)步，人工合成有機(jī)殺蟲劑來防治病蟲害己成為提高農(nóng)作物產(chǎn)量的主要手段之一。然而，隨著各類殺蟲劑不斷投入使用，也帶來了諸如農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性等負(fù)面問題，特別是在寂靜的春天一書出版之后，農(nóng)藥的安全性問題引起了人們更多的關(guān)注。為解決這些問題，新型殺蟲藥劑的研發(fā)已成為眾多農(nóng)藥研究工作者所追求的目標(biāo)。治標(biāo)還需治本，從昆蟲本身尋找其必需的基因，作為農(nóng)藥作用的靶點(diǎn)，然后展開農(nóng)藥研發(fā)是一條可行的殺蟲途徑。這種新型殺蟲劑不僅可以最大限度地控

13、制病蟲害，而且還可以保證生態(tài)平衡不受到破壞，減輕對人類及其他非靶標(biāo)生物的毒害等。近年來，許多化學(xué)家致力于研發(fā)基于海藻糖酶抑制劑的新型農(nóng)藥，試圖通過阻斷有機(jī)體內(nèi)海藻糖的合成或者分解代謝，來達(dá)到殺蟲和抑菌的目的。海藻糖酶作為新型農(nóng)藥開發(fā)的靶標(biāo)，為海藻糖酶抑制劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。從1970年鏈霉菌中分離到井岡霉素A(ValidamycinA, VLA),并將其作為水稻紋枯病防治劑使用以來，已從微生物以及植物細(xì)胞中分離得到了多種海藻糖酶抑制劑，在這些天然小分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過生物電子等排、活性基團(tuán)組合等農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)方法,又不斷地人工合成了許多新型抑制劑。如,井岡霉素A(ValidamycinA, V

14、LA)、井岡霉亞基胺A(ValidoxylamineA, VAA)、Trehazolin、 Salbostatin、MDL25637、Deoxynojirimycin和Castanospermine等10,部分化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下圖所示。在發(fā)揮作用的過程中這些化合物多以其糖苷配基基團(tuán)對海藻糖酶的抑制作用為基礎(chǔ),通過與海藻糖酶活性位點(diǎn)上的氨基酸(Glu、Ala等)相互作用形成復(fù)合物，然后競爭性地抑制海藻糖的水解。海藻糖在海藻糖酶的作用下水解包括以下幾個過程：1. 酶識別(或氫鍵識別),即海藻糖所含的羥基與海藻糖酶的活性位點(diǎn)通過氫鍵進(jìn)行結(jié)合；2. 海藻糖環(huán)上的氧形成氧碳翁離子；3. 酶所含的羧基與氧碳翁

15、離子通過“靜電作用”絡(luò)合；4. 橋頭鍵在水分子的作用下斷裂。井岡霉亞基胺A由井岡霉素A、C、D、E、F的共同糖苷組成，為水溶性多羥基、弱堿性化合物，分子式為Cl4H25NO8，相對分子量為335.35。井岡霉亞基胺A與海藻糖酶的底物海藻糖結(jié)構(gòu)十分相似，對海藻糖酶具有很強(qiáng)的親和力，是通過爭奪海藻糖與海藻糖酶的結(jié)合位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)抑制作用的，是海藻糖的競爭性抑制劑。其作用過程主要是：1. 氫鍵識別，由于井岡霉亞基胺A與海藻糖具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它所含的羥基也可以與酶活性位點(diǎn)形成氫鍵；2. 井岡霉亞基胺A所含的氮質(zhì)子化；3. 酶所含的羧基與質(zhì)子化的氮通過強(qiáng)靜電作用絡(luò)合11。井岡霉亞基胺A對海藻糖酶的抑制活

16、性很高，但它是多羥基的水溶性化合物,很難直接穿透昆蟲體壁到達(dá)“酶靶標(biāo)”,只有通過“注射”用藥，強(qiáng)行使其到達(dá)“酶靶標(biāo)”，才能表現(xiàn)出殺蟲效果。所以，對井岡霉亞基胺A這一先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬，來合成出近似功效的新型殺蟲劑是新農(nóng)藥開發(fā)的新目標(biāo)。井岡霉素A是由一分子葡萄糖和一分子井岡霉亞基胺A通過2糖苷鍵連接構(gòu)成的。對于離體海藻糖酶,井岡霉素A抑制能力要明顯低于其水解產(chǎn)物井岡霉亞基胺A。但是井岡霉素A能迅速地進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中,抑制胞內(nèi)海藻糖酶的活性，盡管離體酶抑制活性降低了幾十倍，但其活體殺菌效果卻提高近百倍，成為目前最為廣泛使用的生物農(nóng)藥。Trehazolin是小單抱菌屬菌株的一種代謝產(chǎn)物,也是一種

17、假二糖抑制劑,具有很高的海藻糖酶抑制活性，對昆蟲、哺乳動物和微生物等海藻糖酶的IC50值在10-8至10-9mol/L水平上。Wegener等給蝗蟲成蟲體內(nèi)注射10微克Trehazolin, 24h后血淋巴中葡萄糖含量下降90%、海藻糖含量增加一倍。雖然Trehazolin對離體海藻糖酶有很強(qiáng)的抑制活性,但是由于結(jié)構(gòu)中含有太多羥基而無法進(jìn)入昆蟲體內(nèi),和井岡霉亞基胺A一樣沒有活體殺蟲活性。人們先后發(fā)現(xiàn)ValidoxylamineA, Salbostatin和Trehazolin等雖然具有很高的離體海藻糖酶抑制活性,但是其活體效果卻很差，并不能很好的到達(dá)酶靶標(biāo)。為此，人們對天然海藻糖酶抑制劑的結(jié)構(gòu)

18、進(jìn)行了不斷優(yōu)化，但是仍停留在局部結(jié)構(gòu)的“微調(diào)”階段，尚無結(jié)構(gòu)簡單且具有實(shí)際農(nóng)藥意義的有效品種開發(fā)成功。對于海藻糖酶抑制劑的篩選不但要解決昆蟲體壁穿透性差、殘效期過長或過短等不足，還應(yīng)該考慮其對其他生物及人類健康所造成的不利影響，使其更好地為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。1.4 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)農(nóng)藥的發(fā)展經(jīng)歷了從傳統(tǒng)的隨機(jī)篩選到基于某一作用靶標(biāo)的生物合理農(nóng)藥分子設(shè)計(jì),這些技術(shù)的發(fā)展都是在確信關(guān)于農(nóng)藥分子與受體相互作用中存在著一條普遍規(guī)律而進(jìn)行的?，F(xiàn)如今,采用各種理論計(jì)算方法和分子圖形模擬技術(shù),在計(jì)算機(jī)輔助下進(jìn)行農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)己經(jīng)成為當(dāng)前國際上農(nóng)藥研究中最為前沿的領(lǐng)域。對于受體三級結(jié)構(gòu)未知的情況,就需要用間接農(nóng)藥

19、分子設(shè)計(jì)。也就是以小分子的構(gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ),從一組小分子化合物的結(jié)構(gòu)和生物活性數(shù)據(jù)出發(fā),使用一些計(jì)算機(jī)方法對藥效團(tuán)進(jìn)行識別,以抽提共同的藥效基團(tuán),進(jìn)而反推受體的模型以指導(dǎo)新型殺蟲藥劑的研發(fā)。這一方法己被最近幾年的研究工作所認(rèn)可,而且更是通過新型農(nóng)藥化合物的成功實(shí)例得以證實(shí)。三維結(jié)構(gòu)已知的受體分子,可采用同源模建其受體的分子結(jié)構(gòu),來尋找新農(nóng)藥的作用靶標(biāo)。這幾種虛擬的農(nóng)藥篩選方法,可以大大減少工作量與成本,加快創(chuàng)新農(nóng)藥研發(fā)的步伐。以下是所立課題的技術(shù)路線：生物活性測試基于海藻糖合成酶結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥設(shè)計(jì)昆蟲海藻糖合成酶蛋白序列的選擇蛋白序列的同源比對海藻糖酶抑制劑的合理篩選與研究基于藥效團(tuán)模型的農(nóng)藥設(shè)計(jì)已

20、有海藻糖水解酶抑制劑的研究藥效團(tuán)構(gòu)象的建立同源模建，結(jié)構(gòu)預(yù)測分子疊合底物與模型相互作用模型的建立分子對接基于藥效團(tuán)的數(shù)據(jù)庫搜索新型先導(dǎo)化合物的篩選海藻糖酶抑制劑的合成全新高效海藻糖酶抑制劑先導(dǎo)化合物海藻糖酶的分離與純化1.5研究意義新型殺蟲劑的研究旨在發(fā)現(xiàn)、開發(fā)一種安全高效的新品種，并最大限度地提高作物產(chǎn)量及確保對公眾的健康?？傮w來說，當(dāng)今農(nóng)藥研究開發(fā)的趨勢主要集中在以下幾個方面:繼續(xù)研究開發(fā)生物合理性的、低劑量的殺蟲劑；大力研發(fā)天然的殺蟲劑和以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物的、作用機(jī)理獨(dú)特的新型藥劑；生物農(nóng)藥和基因工程作物的研究將更加廣泛；對昆蟲生長調(diào)節(jié)劑及昆蟲代謝機(jī)理的研究將更加深入。 由于威脅人類

21、健康的疾病及蟲害的不斷衍生，害蟲的抗藥性也隨著農(nóng)藥靶標(biāo)分子的缺乏而逐漸增強(qiáng)，毫無疑問，更多的科學(xué)挑戰(zhàn)仍將繼續(xù)。由于到目前為止，還沒有商品化的海藻糖酶抑制劑類農(nóng)藥品種，本課題將在已研究的基礎(chǔ)上，針對發(fā)展還很不成熟的海藻糖酶抑制劑提出合理的設(shè)計(jì)方法，有利于海藻糖酶抑制劑的發(fā)展和創(chuàng)新，同時(shí)也可以改善當(dāng)前一些農(nóng)藥造成的對非靶標(biāo)物和環(huán)境造成的危害。第二章 新型海藻糖合成酶抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選研究2.1前言在藥物分子設(shè)計(jì)中,基于受體的合理藥物設(shè)計(jì)占有極其重要的地位。先導(dǎo)化合物的篩選方法分為兩種，一種為隨機(jī)篩選，也稱為高通量篩選，是以大量的化合物為基礎(chǔ)，進(jìn)行廣泛的生物活性測試，從中找出具有研發(fā)價(jià)值的先導(dǎo)化

22、合物，這種篩選方法帶有一定的隨機(jī)性與盲目性，且耗資、耗時(shí)、耗力，效率低。另一種方法一般來說,是在通過X-單晶衍射技術(shù)或多維NMR獲得受體生物大分子結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)后,就可以采用分子模擬軟件分析結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)性質(zhì),特別是靜電場、疏水場、氫鍵作用位點(diǎn)等分布信息,然后再運(yùn)用數(shù)據(jù)庫搜尋或運(yùn)用全新藥物分子設(shè)計(jì)技術(shù),識別得到分子形狀和理化性質(zhì)與受體作用位點(diǎn)相匹配的分子結(jié)構(gòu),合成并測試這些分子的生物活性。經(jīng)過幾輪循環(huán),可發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物。這種篩選方法具有更強(qiáng)的針對性和目的性,可以減少藥物研發(fā)過程中的人力和資金浪費(fèi)，降低新藥的研發(fā)成本,縮短新藥的開發(fā)周期。目前基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)可分為兩大類:一類是根據(jù)受體

23、活性位置來構(gòu)建配體,也就是全新藥物設(shè)計(jì)(de novodrug design);另一類是以受體結(jié)構(gòu)來搜尋配體,也就是分子對接(molecular docking)利用計(jì)算機(jī)的強(qiáng)大運(yùn)算功能,根據(jù)某個靶點(diǎn)的相關(guān)性質(zhì),利用分子對接或三維藥效團(tuán)搜索等方法在各種化合物庫中尋找可能與靶標(biāo)有較好相互作用的潛在活性化合物分子,向提供這些化合物的公司購買或自己合成這些分子后,進(jìn)行相應(yīng)的藥理活性測試。與傳統(tǒng)的實(shí)體化合物高通量蹄選技術(shù)相比,虛擬蹄選能更快地對大型化合物庫進(jìn)行搜索,高效地命中分子,且不存在樣品的限制,其成本遠(yuǎn)低于高通量蹄選,擁有很好的性價(jià)比。針對昆蟲代謝過程中主要的供能物質(zhì)海藻糖，從以下五個步驟展開對

24、昆蟲飛行抑制劑的篩選工作。1）分析現(xiàn)有關(guān)于海藻糖合成酶的序列信息及實(shí)驗(yàn)方法，對昆蟲體內(nèi)的海藻糖合成酶展開進(jìn)化分析，尋找突破點(diǎn);2）對現(xiàn)有的海藻糖合成酶序列信息進(jìn)行同源性分析，模建其三維結(jié)構(gòu)，尋找昆蟲體內(nèi)海藻糖合成酶的活性位點(diǎn)。針對其活性位點(diǎn)，進(jìn)行分子對接，動力學(xué)優(yōu)化等:3)在上述工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)行小分子先導(dǎo)化合物的篩選;5）進(jìn)行環(huán)境友好測試，以評價(jià)其毒性及致突變性。2.2 海藻糖酶抑制劑的虛擬篩選2.2.1 昆蟲海藻糖合成酶蛋白序列的選擇海藻糖合成酶廣泛分布于細(xì)菌，真菌等多個物種,由于哺乳動物不能自行合成海藻糖，因此機(jī)體內(nèi)也不存在這一糖苷合成酶。通過搜索蛋白質(zhì)保守區(qū)域數(shù)據(jù)庫，也可以發(fā)現(xiàn),海藻糖

25、合成酶在進(jìn)化過程具有一定程度的保守性,來源于不同物種的海藻糖合成酶,蛋白同源性很高12。方法：以小分子的構(gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ),從一組小分子化合物的結(jié)構(gòu)和生物活性數(shù)據(jù)出發(fā),使用計(jì)算機(jī)方法對藥效團(tuán)進(jìn)行識別,以抽提共同的藥效基團(tuán),進(jìn)而反推受體的模型。2.2.2同源序列比對使用基于序列和結(jié)構(gòu)相似性的FUGUE比對程序,找到一段同源的蛋白結(jié)構(gòu)。并確認(rèn)其是一個可信的蛋白模板。2.2.3 蛋白的同源模建蛋白虛擬結(jié)構(gòu)的建立,采用Accelrys Discovery Studio軟件包來完成。根據(jù)序列對比結(jié)果,將蛋白分為海藻糖磷酸合成酶功能區(qū)(A) 和海藻糖磷酸酶功能區(qū)(B)兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域，再進(jìn)行模擬篩選較為合適的蛋白

26、構(gòu)型。模擬結(jié)束時(shí),即產(chǎn)生許多個虛擬結(jié)構(gòu)。利用Accelrys Discovery Studio/homology的profile_3D/verify模塊來計(jì)算模板與我們模建的結(jié)構(gòu)是否兼容。假如氨基酸的Compatibility Score為負(fù)數(shù)時(shí),則可能是結(jié)構(gòu)有誤的區(qū)域。另外,依照結(jié)構(gòu)的大小計(jì)算整個蛋白的預(yù)期的總數(shù), 假如總數(shù)低于最小值,則表示此結(jié)構(gòu)是不正確的結(jié)構(gòu)。2.2.4 底物CG4104-PA(A)與模型相互作用模型的建立 由于該底物在昆蟲體內(nèi)的主要功能是作為海藻糖合成過程中的糖苷酶。而在同源模建過程中我們選1GZ5作為CG4104-PA(A)的模板,因此通過分析1GZ5與其配體的相互作

27、用，我們就可以大體得知，模建后的蛋白在昆蟲體內(nèi)的活動情況。2.2.5 活性位點(diǎn)的搜素與基于受體-配體相互作用的分子對接的展開Sybyl7.0/SitelD模塊可以用來確定在生物大分子靶點(diǎn)內(nèi)部或表面上潛在的結(jié)合位點(diǎn)，通過兩種模式來識別受體與配體的潛在結(jié)合部位,一種模式是溶劑化受體結(jié)構(gòu)表面來定位溶劑球趨向聚集的區(qū)域從而快速識別蛋白質(zhì)空腔;另一種模式是通過對分子表格進(jìn)行詳細(xì)地分析來識別可能的活性位點(diǎn)。分別利用兩種方法,搜索虛擬蛋白的活性位點(diǎn),基于上述受體模型的活性位點(diǎn)氨基酸分布情況,我們就可以基本確定其與配體分子的相互作用情況,然后展開基于受體-配體相互作用的分子對接并對其結(jié)果利用Surflex-D

28、ock和FlexX-Pharm constraints進(jìn)行虛擬篩選。第三章 海藻糖水解酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與生物活性測定3.1 前言傳統(tǒng)的藥物分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是基于化合物的結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系，根據(jù)各基團(tuán)在靜電場和立體場中所做的貢獻(xiàn)，選擇出可能使化合物生物活性提高的官能團(tuán)，藥效團(tuán)模型和QSAR方法就是基于這種理論來進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。該方法在早期的藥物研究中起到了重要的作用。本章主要通過分析已知的海藻糖水解酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)，確定藥效團(tuán)，使篩選一個全新、有效的化合物成為可能?；贕asp模塊，尋找到了一系列配體結(jié)構(gòu)中與受體作用密切的關(guān)鍵官能團(tuán)，從而完成新型先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)。3.2海藻糖酶抑制劑

29、的設(shè)計(jì)3.2.1藥效團(tuán)構(gòu)象的建立先導(dǎo)化合物活性構(gòu)象的確定是工作開展的第一步。利用文獻(xiàn)搜索，我們已找到多種小分子抑制劑。首先使用Chemoffice8.3構(gòu)建從文獻(xiàn)報(bào)道中獲取的Salbostatin、Validoxylamine、Trehazolin、Deoxynijirimyein等四個小分子先導(dǎo)化合物,利用分子力學(xué)的方法優(yōu)化四個小分子的結(jié)構(gòu),確定分子的低能構(gòu)象。使用三維分子模擬軟件Sybyl7.0,將以上四種小分子的結(jié)構(gòu)信息以MOL2的格式輸入,并用Maximin2分子力學(xué)方法再次優(yōu)化分子能量和構(gòu)象,確保分子構(gòu)象的能量最優(yōu)。將建立完畢的分子存入數(shù)據(jù)庫。3.2.2 分子疊合隨后基于Sybyl軟

30、件包中的Gasp(Genetic Algorithm Similarity Program)模塊，判斷一系列配體結(jié)構(gòu)中與受體作用密切的關(guān)鍵官能團(tuán)。3.2.3 基于藥效團(tuán)的數(shù)據(jù)庫搜索基于Gasp建立的模型，使用數(shù)據(jù)庫檢索模塊Unity，展開基于藥效團(tuán)的柔性三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫搜索。作為Sybyl中的一個重要工具，Unity包含兩個重要的模塊:Unity Base和Unity 3D。其中Unity 3D提供最基本的基于二維結(jié)構(gòu)的檢索功能。使用Unity 3D,選擇LQ Sample數(shù)據(jù)庫,展開基于已定義的活性官能團(tuán)特征的三維結(jié)構(gòu)檢索。3.3 海藻糖酶抑制劑的合成與測定3.3.1 合成利用有機(jī)合成的方法，

31、選擇經(jīng)濟(jì)的原料合成目標(biāo)產(chǎn)物，并對目標(biāo)產(chǎn)物分子進(jìn)行紅外光譜測試，核磁共振以及質(zhì)譜分析，確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致。3.3.2 海藻糖酶的分離純化目前,已經(jīng)從昆蟲、哺乳動物、微生物和植物等分離得到了海藻糖酶,其中昆蟲來源的海藻糖酶研究最多。由于分離方法的限制,早期分離海藻糖酶一般采用比較簡單的分級沉淀方法。1957年,Kalf等13通過30%硫酸銨沉淀、加熱、40%70%硫酸銨分級沉淀和丙酮沉淀等方法從蠟螟的幼蟲中分離得到海藻糖酶,純化倍數(shù)達(dá)到了114倍。目前報(bào)道的海藻糖酶的分離純化大多采用硫酸銨分級沉淀、凝膠層析、疏水層析和離子交換層析等常規(guī)的分離技術(shù)。Lee等14以蜜蜂為來源分離得到海藻糖

32、酶,酶液先經(jīng)過硫酸銨沉淀,再分別經(jīng)過DEAE-Sepharose CL-6B、CM-Sepharose CL-6B、Butyl-toyo-pearl 650M、DEAE-Sepharose CL-6B和p-Aminophe-nylB-glucoside-sepharose 4B等柱層析分離,酶的純化倍數(shù)達(dá)到5380倍,總收率高達(dá)7711%,是目前報(bào)道的純化倍數(shù)最高的海藻糖酶。根據(jù)酶與底物、底物結(jié)構(gòu)類似物、輔助因子和抑制劑等的特異親和力,可使用親和層析技術(shù),采用較少的分離步驟取得較好的分離效果。Valaitis等15分別采用兩種不同的方法分離舞毒蛾中腸的海藻糖酶,采用親和層析技術(shù),從鹽析處理的粗

33、酶液出發(fā),以海藻糖為配基,利用海藻糖酶能與海藻糖特異性結(jié)合的能力,親和層析純化海藻糖酶,再經(jīng)過凝膠電泳,酶的純化倍數(shù)可達(dá)到609倍,比另一種常規(guī)層析分離方法的效果好得多。3.3.3 生物活性檢測海藻糖酶抑制劑的生物活性通過測定抑制劑作用前后，害蟲提取液中海藻糖酶活性的變化而測得。取待測麥長管蚜提取溶液0.25mL，加入pH 5.8，0.02 mol/L PBS 0.25mL，加入 1mL海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2mmol /L），37水浴30min，沸水浴2-3min終止反應(yīng)，冰浴冷卻后移入10mL試管，加入2mL顯色劑（3，5-二硝基水楊酸5g，氫氧化鈉5g，苯酚1g，無水亞硫酸鈉0.25g，定容至

34、500mL）于90加熱5min，冰水浴冷卻后加入40 %的四水合酒石酸鉀鈉水溶液0.5mL混勻，然后在550nm 下測定OD，并確定OD值與葡萄糖含量之間的對應(yīng)關(guān)系，該葡萄糖為海藻糖在海藻糖酶的作用下所形成的葡萄糖。每個處理及對照重復(fù)3次，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定不同處理下麥長管蚜的蛋白質(zhì)含量。16海藻糖酶活性以mol葡萄糖·L-1 mg pro-1· min-1表示。第四章 總結(jié)及展望4.1總結(jié)通過干擾海藻糖在生物機(jī)體內(nèi)的合成與代謝過程，來達(dá)到殺蟲、抑菌的目的，已成為農(nóng)藥研發(fā)的新方向。本研究課題的目的是對海藻糖酶這一靶酶及其抑制劑進(jìn)行

35、深入的研究，利用幾個計(jì)算機(jī)輔助軟件展開基于結(jié)構(gòu)及基于藥效團(tuán)的農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)工作。主要由以下三點(diǎn)： 1）分析現(xiàn)有關(guān)于海藻糖合成酶的序列信息及實(shí)驗(yàn)方法，明確了在長期的進(jìn)化過程中，無脊椎動物海藻糖合成酶己發(fā)生基因融合。編碼海藻糖-6-磷酸合成酶及海藻糖-6-磷酸酷酶的基因已被一小段的內(nèi)含子連接到一起。這對于后續(xù)工作的開展，將具有指導(dǎo)性的意義。 2）利用同源模建的方法，構(gòu)建海藻糖合成酶的三級結(jié)構(gòu)。使用分子對接及Profile-3D技術(shù)，對此虛擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)合理性評價(jià)。同源模建的結(jié)果對于海藻糖合成酶抑制劑的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。基于此配體-受體復(fù)合物的信息展開，通過搜尋三維及二維數(shù)據(jù)庫，最終可以尋找到一

36、些結(jié)構(gòu)全新的抑制劑分子。理論上來說，這些命中的結(jié)構(gòu)均是符合受體-配體的空間結(jié)構(gòu)特征信息的分子，它們的新穎結(jié)構(gòu)將會給篩選工作的開展提供一個更廣闊的空間。 3)就以往的研究來看，盡管海藻糖水解酶抑制劑的篩選已取得了一些進(jìn)展，但仍存在許多問題，如昆蟲體壁穿透性差、殘效期過長或過短等。同時(shí)，由于海藻糖水解酶的晶體結(jié)構(gòu)仍屬未知，因此尚不能進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)和篩選，這大大阻礙了該領(lǐng)域的進(jìn)展。2研究展望針對海藻糖酶抑制劑的研究有很大的發(fā)展空間，現(xiàn)有的可利用資源對后續(xù)工作的開展將具有很大的幫助。雖然從細(xì)胞學(xué)水平上，還不能對昆蟲機(jī)體內(nèi)海藻糖酶及中間產(chǎn)物進(jìn)行詳盡的解釋和說明，但是結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)

37、方法和技術(shù)，我們可以大大加快海藻糖酶抑制劑發(fā)現(xiàn)的過程，減少新農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)的盲目性和偶然性。 綜上所述，創(chuàng)新農(nóng)藥的研發(fā)，不僅要著眼于農(nóng)藥分子在靶標(biāo)生物體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸和代謝，還要考慮到它們與環(huán)境以及非靶標(biāo)生物的相容性。從昆蟲飛行這一重要生理過程中出發(fā)，尋找相應(yīng)的農(nóng)藥作用的潛在靶標(biāo)，結(jié)合藥物定量構(gòu)效關(guān)系、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等方法，完全有可能研發(fā)出高效、低毒、特異性強(qiáng)、對環(huán)境友好的新型農(nóng)藥。參考文獻(xiàn)1 于彩虹盧丹林榮華王曉軍姜輝趙飛，海藻糖昆蟲的血糖，昆蟲知識，2008,45,52 張立媛,賁亞俐,劉德立, 靶標(biāo)酶在農(nóng)藥研發(fā)中的作用，化學(xué)與生物工程，2008,25,23 范柯琴,金利群,鄭裕國，海藻糖酶的酶學(xué)特性及其作為新農(nóng)藥靶標(biāo)的開發(fā)應(yīng)用，化學(xué)生物工程，2009,44 于彩虹，黃瑩，林榮華等.五種昆蟲可溶性海藻糖酶活性比較.植物保護(hù)，2013. 39 (4):5 -95 Lee ,J, Saito S, Mori, et al. Molecu