細(xì)胞工程習(xí)題

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)習(xí)題（含答案）第一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概述一、名詞解釋細(xì)胞培養(yǎng)：是指將動(dòng)物活體體內(nèi)取出的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單細(xì)胞懸浮液，然后放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境中，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方法。組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。器官培養(yǎng)：將活體內(nèi)的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基取出，在體外培養(yǎng)的方法。二、填空題1. 體外培養(yǎng)（或組織培養(yǎng)）主要包括細(xì)胞培養(yǎng)_，組織培養(yǎng)_，和器官培養(yǎng)_三種類型。2. _Harrison_的實(shí)驗(yàn)開創(chuàng)了動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的先河，他建立了蓋玻片懸滴_培養(yǎng)法3. 在卡氏瓶原理的啟發(fā)下，出現(xiàn)了用試管培養(yǎng)，繼而又出

2、現(xiàn)了多種類型的_培養(yǎng)瓶、一培養(yǎng)皿和多孔培養(yǎng)板_的培養(yǎng)。從20世紀(jì)40年代開始，大多數(shù)培養(yǎng)工作都過渡到用瓶子_培養(yǎng)4. 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的發(fā)展過程中，具有歷史意義的培養(yǎng)方法有蓋玻片懸滴培養(yǎng)法，_旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法_,_灌注小室培養(yǎng)法和目前普遍應(yīng)用的單層細(xì)胞培養(yǎng)法5. 早期細(xì)胞培養(yǎng)采用_天然-培養(yǎng)基,現(xiàn)在廣泛采用添加血清的_人工合成培養(yǎng)基,近二十年來，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)朝著無(wú)血清_培養(yǎng)基的方向發(fā)展。三問答題1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用到那些領(lǐng)域？請(qǐng)舉例說明。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)幾乎已應(yīng)用到生物、醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。這門技術(shù)自創(chuàng)立至今，已在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域乃至生產(chǎn)實(shí)踐中均發(fā)揮了巨大的作用。一、在生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研

3、究中的應(yīng)用離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞具有培養(yǎng)條件可人為控制且便于觀察檢測(cè)的特點(diǎn)，因而可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究中。1 .在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用2 在遺傳學(xué)上的應(yīng)用除了可用培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行染色體分析外，還可結(jié)合細(xì)胞融合技術(shù)建立細(xì)胞遺傳學(xué)，進(jìn)行遺傳分析和雜交育種。3 在胚胎學(xué)上的應(yīng)用通過體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞，并進(jìn)行體外受精、技術(shù)而應(yīng)用于家畜的繁殖生產(chǎn)中。4 .在病毒學(xué)上的應(yīng)用胚胎分割和移植己發(fā)展成了一種較成熟的在制備減毒活疫苗和診斷用抗原時(shí)，離不開細(xì)胞這一病毒增殖的場(chǎng)所。另外，在病毒學(xué)研究中，用培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞代替試驗(yàn)動(dòng)物做斑點(diǎn)分析.5.在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用二、在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)

4、前診斷目前，人們已經(jīng)能夠用羊膜穿刺技術(shù)獲得脫落于羊水中的胎兒細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行染色體分析或甲胎蛋白檢測(cè)即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。2用于癌癥的早期診斷和預(yù)防我國(guó)的科學(xué)工作者通過培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，病人，以便進(jìn)行及早的預(yù)防和治療。3用于臨床治療并對(duì)其染色體進(jìn)行對(duì)比分析檢測(cè)出易患癌癥的4用于藥物效應(yīng)的檢測(cè)檢測(cè)治療肝病的藥物可選用肝細(xì)胞、檢測(cè)抗癌藥物可選用癌細(xì)胞。三、在動(dòng)物育種上的應(yīng)用四、在生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些要求和那些方法？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工作的基本要求：1. 培養(yǎng)前準(zhǔn)備2 操作間消毒3 洗手和著裝4 火焰消毒5 .實(shí)驗(yàn)中的操作要求動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工作的工作方法：細(xì)胞培養(yǎng)是

5、一種操作程序比較復(fù)雜、需求條件多而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)性工作，工作時(shí)必須注意一定的方法，主要有以下幾點(diǎn)予以重視。將所有操作程序如洗刷、配液、消毒等，制定出統(tǒng)一的規(guī)范和要求，并在一定時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定和要求人人遵守。各種用液（培養(yǎng)液、胰蛋白酶、Hanks液、NaHCO、抗生素液）均應(yīng)由專人負(fù)責(zé)配制，并保證做到制備濃度精確、滅菌可靠。所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標(biāo)簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放地點(diǎn)，其中尤為重要的是，培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，已消毒與末消毒品應(yīng)嚴(yán)格分開存放。以上一切措施都是為了避免各種雜質(zhì)混入細(xì)胞生存環(huán)境、防止微生物感染和細(xì)胞“污染”。所謂細(xì)胞

6、污染，是指不同細(xì)胞之間因操作不當(dāng)造成的相互混雜，使細(xì)胞群體不純的現(xiàn)象。近年來世界上不少實(shí)驗(yàn)室都出現(xiàn)過這種事故，應(yīng)引起注意。第二章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)一、名詞解釋貼壁依賴性細(xì)胞：細(xì)胞必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)，因此又稱為貼壁型細(xì)胞。非貼壁依賴性細(xì)胞：細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)不需要貼附于支持物表面，可以懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，這種細(xì)胞又稱為懸浮型細(xì)胞。接觸抑制：是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞在貼附底物上連接成片、相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象，這是某些貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞的特征之一。無(wú)限細(xì)胞系：由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，即細(xì)胞獲得持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系。脫分化：指的是細(xì)胞在體外不可逆地失

7、去它們?cè)械奶匦?。二、填?. 體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞其生長(zhǎng)方式主要貼壁生長(zhǎng)和懸浮生長(zhǎng)兩種，分別稱為貼壁型細(xì)胞和懸浮型細(xì)胞。體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞其生長(zhǎng)方式以貼附生長(zhǎng)為主。2. 貼壁生長(zhǎng)的體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，按形態(tài)來分，大體分為成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多形細(xì)胞型四種類型，最常見的為前兩種。3. 細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)具有一些特點(diǎn)，其中主要是貼附生長(zhǎng)、接觸抑制和密度依賴性。4. 培養(yǎng)細(xì)胞生命期可分為原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期、衰退期三個(gè)階段。三、問答題1. 什么是培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期？培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期可分為哪幾個(gè)階段？各有何特點(diǎn)？答：a,細(xì)胞的一代生存期指從細(xì)胞接種到下一次再傳代接種的一段時(shí)間。b

8、,培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期分為潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期、停滯期三個(gè)階段。C,潛伏期：又分為懸浮期，細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈球形；貼壁期，細(xì)胞開始附著或貼附于底物表面上，并逐漸伸展；潛伏期，細(xì)胞可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見分裂相。指數(shù)生長(zhǎng)期：是細(xì)胞一代中活動(dòng)最好的時(shí)期，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)生長(zhǎng)，在接種適宜的情況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)一段時(shí)間后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度，細(xì)胞停止增殖，但仍有細(xì)胞代謝活動(dòng)，接著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累，PH降低。2. 培養(yǎng)細(xì)胞需要哪些營(yíng)養(yǎng)？它需要在什么樣的環(huán)境下生長(zhǎng)？這些環(huán)境如何獲得？答：A.營(yíng)養(yǎng)需要：

9、氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素、促生長(zhǎng)因子及一些生長(zhǎng)必須的鉀、鈉、鐵等元素。B. 生存環(huán)境：培養(yǎng)用水充足，培養(yǎng)溫度及PH適宜，氣體條件及滲透壓適宜，還有無(wú)毒無(wú)菌無(wú)污染的培養(yǎng)環(huán)境。C. 環(huán)境的獲得：3. 培養(yǎng)細(xì)胞需要哪些主要儀器？在使用時(shí)需要注意什么？第三章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備工作一、填空題1、玻璃器皿的清洗程序主要包括浸泡_、刷洗、浸酸、和沖洗。2、目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的浸酸酸液的主要成分是濃硫酸和重鉻酸鉀。3、細(xì)胞培養(yǎng)用品的包裝主要包括局部包裝和全包裝兩種類型，如前者適宜的器皿有燒杯、容量瓶等，后者適宜的器皿有注射器、膠塞等。細(xì)胞培養(yǎng)中塑料制品中主要采用射線消毒方法進(jìn)行滅菌，人工合成培養(yǎng)基

10、和酶液采用過濾消毒方式進(jìn)行滅菌。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)者的皮膚主要用75%的酒精或新潔爾滅來消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)室地面采用來蘇兒定期拖洗消毒，培養(yǎng)室空氣可以用紫外線或乳酸蒸汽-消毒。BSS中文名稱為平衡鹽溶液_,具有維持滲透壓、穩(wěn)定PH等作用，常用作洗滌組織和細(xì)胞以及配置各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中常用的消化液有胰蛋白酶消化液_、膠原酶消化液和EDTA-2Na三種，常在貼附型細(xì)胞原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)中用來離散細(xì)胞。要想取得好的細(xì)胞培養(yǎng)效果，在合成培養(yǎng)基中添加天然培養(yǎng)基構(gòu)成完全培養(yǎng)基是非常必要的，通常它的滅活處理方法是熱滅活。二、簡(jiǎn)答題1、塑料制品的清洗步驟是什么？答：塑料器皿耐腐蝕能力強(qiáng)，但質(zhì)

11、地軟，大多不耐熱。塑料器皿的清洗意識(shí)要防止劃痕，二是用后要立刻浸入清水中，嚴(yán)防附著物干結(jié)。如果殘留有附著物，可先用脫脂棉輕輕擦掉，再用流水沖洗干凈，接著用2%勺NaOH夜浸泡過夜，取出后用自來水沖洗8-10次，然后用3%-5%鹽酸溶液浸泡15-30分鐘，取出后用自來水沖洗多次，在在雙蒸水漂洗5-6次，倒凈器皿內(nèi)的雙蒸水，置37度恒溫箱內(nèi)晾干即可。2、用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)應(yīng)注意什么？答；濕熱滅菌時(shí)，消毒品不能裝得過滿，以保證消毒器內(nèi)氣體的流通，在加熱升壓之前先要打開排氣閥門，排除殘留在容器內(nèi)的冷空氣，導(dǎo)氣管一定要沿著滅菌鍋內(nèi)膽上的升制的通氣孔道到達(dá)灌的底部并且不能堵塞。冷空氣排盡后，關(guān)

12、閉排氣閥門；繼而開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需要的壓力時(shí)，通過調(diào)節(jié)高壓蒸氣鍋的電源開關(guān)，是壓力穩(wěn)定在所需數(shù)值后并開始計(jì)算時(shí)間。在消毒過程中，消毒者不能離開，要經(jīng)常檢查壓力是否恒定，如有偏離，應(yīng)及時(shí)調(diào)整。3、谷氨酸胺在培養(yǎng)基中的主要作用是什么？配液時(shí)應(yīng)該注意哪些問題？答：1）谷氨酰胺的作用：在細(xì)胞的代謝工程中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)的必需的氨基酸；缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)不良而死亡。培養(yǎng)液在4°C冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。一般來說，谷氨酰胺溶液都是單獨(dú)配制的，以便在需要時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。常把其配制成100倍的濃縮母液，濃度為200mmol/L（L）。使用

13、時(shí)，在每100ml培養(yǎng)液中加入一2ml谷氨酰胺母液，使其終濃度為14mg/L即可。4、人工培養(yǎng)基常用的有哪些（列舉12種）？采用人工培養(yǎng)基有什么優(yōu)點(diǎn)？答：1）人工培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基：主要有有MEM培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，RPM1640培養(yǎng)液，HamF12培養(yǎng)液等等。2）采用人工培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：因?yàn)楹铣膳囵B(yǎng)基是根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)所需成分人工模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基，其主要成分是氨基酸，維生素，碳水化合物，鹽離子和一些其他輔助物質(zhì)，培養(yǎng)基成分固定，有利于控制實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化，合成培養(yǎng)基的應(yīng)用促進(jìn)了培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)展，合成培養(yǎng)基可以用于特殊研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作，雜交瘤技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

14、，單細(xì)胞培養(yǎng)等等方面。2）配液時(shí)應(yīng)該注意的問題：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20°C冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液中。因?yàn)楣劝滨０吩?°C下放置7d就會(huì)分解50%，所以已含谷氨酰胺的5、胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中起什么作用？如何從外觀大致判斷血清質(zhì)量的好壞？胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)許多細(xì)胞系均有促生長(zhǎng)作用，主要用于細(xì)胞株的保藏以及特殊嬌貴細(xì)胞株的體外培養(yǎng)。質(zhì)量好的血清應(yīng)該是透明清亮的土黃色或棕黃色，無(wú)沉淀或是極少量沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含有許多沉淀物，說明血清污染或是血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象；如果搖晃

15、時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中滲入的生理鹽水太多。6、完全培養(yǎng)基中各成分在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的作用分別是什么？答：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清、抗生素等物質(zhì)后成為完全培養(yǎng)基，也叫（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基根據(jù)添加血清量的多少，可分為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和細(xì)胞維持培養(yǎng)基兩種。完全培養(yǎng)基中的成分包括氨基酸，碳水化合物，維生素，無(wú)機(jī)鹽類，促生長(zhǎng)因子，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素等等，除此之外，還需加入牛血清。各成分作用列舉如下：1）氨基酸：細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料，保證細(xì)胞正常的生理代謝過程；2）碳水化合物：細(xì)胞生長(zhǎng)主要的能量來源，有些糖類是合成氨基酸，脂肪，核酸的原料；3）維生素：細(xì)胞生長(zhǎng)必不可少的有機(jī)化合物，幫助細(xì)

16、胞維持滲透壓平衡和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能，有些無(wú)機(jī)鹽是維生素，激素，酶形成中的原料；4）促生長(zhǎng)因子：對(duì)于維持細(xì)胞功能，保持細(xì)胞的狀態(tài)具有十分重要的作用；促進(jìn)細(xì)胞增殖；5）牛血清：血清含有各種氨基酸，維生素，無(wú)機(jī)物，脂類物質(zhì)，核酸衍生物都是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；也提供激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中少有的營(yíng)養(yǎng)成分，低分子營(yíng)養(yǎng)物等；提供結(jié)合蛋白，識(shí)別維生素，脂類，金屬離子，調(diào)變物質(zhì)能力；與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用；是細(xì)胞貼壁，鋪展所需因子的來源，第四章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法一、名詞解釋原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體進(jìn)行細(xì)胞分離之后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是將組

17、織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法是常用的，簡(jiǎn)便易行的以及成功率較高的原代培養(yǎng)方法。消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法是采用組織消化分散法將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，從而易于外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞濃度為縱軸作圖，即得生長(zhǎng)曲線。傳代細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代。二、填空1、組織塊的分離方法有機(jī)械分散法、剪切分離法、消化分離法。2、目前，較常用的消化試劑有胰蛋白酶、膠原酶、EDTA

18、消化液。3、接種培養(yǎng)瓶的細(xì)胞數(shù)量一般為5X105-1X106/ml。4、培養(yǎng)細(xì)胞的污染一般包括微生物污染、細(xì)胞交叉污染質(zhì)的污染。5、細(xì)胞凍存時(shí)DMSC常用的濃度為10%的濃度。三、判斷（正確畫“V”，錯(cuò)誤畫“X“）1、一般來說，成熟個(gè)體較胚胎容易培養(yǎng)，正常組織較腫脹凈組織容易培養(yǎng)。（X）2、分離液體性原代細(xì)胞懸液時(shí)，可采用長(zhǎng)時(shí)間高速離心。（X）3、消化過程中使用的液體應(yīng)不含CaT和Mf。（V）(V)X)(X)4、培養(yǎng)液變黃、常溫，一般是由細(xì)菌污染引起。5、消化傳代法一般用于懸浮細(xì)胞的傳代。6、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的方式應(yīng)采用快凍慢融法。四、問答題1、原代取材培養(yǎng)時(shí)有哪些基本要求？P59答：(1)無(wú)菌

19、取材(2)取材器械要鋒利(3)及時(shí)培養(yǎng)(4)剔除與培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)關(guān)的成分(5)營(yíng)養(yǎng)要豐富(6)采用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)(7)注意保存原代培養(yǎng)組織的相關(guān)材料及信息。2、如何分離原代組織材料？P61答：1.細(xì)胞懸液的分離方法：對(duì)于細(xì)胞懸液，可采用低速離心法分離。一般用5001000r/min離心510min。2. 組織塊的分離方法：(1)機(jī)械分散法在對(duì)一些纖維成分很少的組織，如腦組織部分胚胎組織以及一些腫瘤組織等進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接用機(jī)械方法進(jìn)行分散?，F(xiàn)在較為常用的是用注射器針芯擠壓組織塊通過不銹鋼篩網(wǎng)的方法。(2)剪切分離法：在進(jìn)行組織塊移植培養(yǎng)時(shí)，可以采用剪切法，即將組織剪或切成1mm3左右的小塊

20、后分離培養(yǎng)。(3)消化分離法：消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成糊狀的組織進(jìn)一步的方法。常用的消化方法有：胰蛋白酶消化法和膠原酶消化法。3、細(xì)胞的常規(guī)檢查包括哪些內(nèi)容？P65答：細(xì)胞的常規(guī)檢查包括：(1)培養(yǎng)液重點(diǎn)觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。(2)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：用倒置顯微鏡觀察。(3)細(xì)胞形態(tài)變化：對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)不良的細(xì)胞首先要查明原因，采取相應(yīng)措施進(jìn)行處理，如換液、排除污染、廢棄等。(4)微生物污染：主要包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌、支原體等的污染。4、你如何認(rèn)定培養(yǎng)細(xì)胞被微生物污染了？怎樣排除微生物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的污染？微生物污染主要包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌、支原體等的污染。細(xì)菌、霉菌、酵母菌污染最

21、典型的表現(xiàn)為培養(yǎng)液渾濁，液體內(nèi)漂浮菌絲或細(xì)菌。支原體污染時(shí)則不同，對(duì)于傳代穩(wěn)定、生長(zhǎng)規(guī)律的細(xì)胞系，往往表現(xiàn)為培養(yǎng)條件沒有改變而細(xì)胞生長(zhǎng)卻明顯變緩、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多、有中毒表現(xiàn)，但培養(yǎng)液多不發(fā)生渾濁，即可考慮為支原體污染。細(xì)菌和霉菌的污染多發(fā)生在傳代、換液和加藥等操作之后，霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生有毒物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。真菌污染及排除:污染培養(yǎng)細(xì)胞的真菌種類很多，常見的有煙曲霉、黑曲霉等，霉菌污染一般肉眼可見，交易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不渾濁，在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。瓶外的污染物需及時(shí)用酒精棉球擦洗清涂，以防其通過瓶口傳入瓶?jī)?nèi)；如被污染可考慮采用制霉菌素25ug

22、/ml或酮康唑10ug/ml對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。細(xì)菌污染及排除：常見的污染菌有大腸桿菌、白色葡萄球菌等?？股貙?duì)預(yù)防和殺滅細(xì)菌有一定效果?？股芈?lián)合使用比單獨(dú)使用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用效果好。如已發(fā)生細(xì)菌污染，在使用抗生素，常難以根除。有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，可使用510倍常用抗生素劑量的沖擊方法，加藥作用2428h，在換入常規(guī)培養(yǎng)液中，有時(shí)可排除污染。支原體污染的排除：a抗生素處理，如使用四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、泰樂菌素及一些氟喹諾酮等；b高熱處理，將受污染的細(xì)胞置41C作用510h,最長(zhǎng)達(dá)18h，可以破壞支原體。;c巨噬細(xì)胞和抗生素聯(lián)合處理；d鼠的傳代處理；e血清處理。5、如何進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞

23、的運(yùn)輸？P74應(yīng)根據(jù)運(yùn)輸時(shí)間長(zhǎng)短或距離遠(yuǎn)近來進(jìn)行不同的細(xì)胞裝運(yùn)。1. 長(zhǎng)距離運(yùn)輸（幾天） 選擇生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞，去掉陳舊培養(yǎng)液，補(bǔ)充新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋。這樣可避免由于液體晃動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。 瓶口用膠帶纏緊密封，并用棉花包裹（做防震防壓處理）。 到達(dá)目的地后，吸出多余的培養(yǎng)液（此液可繼續(xù)使用），保留細(xì)胞生長(zhǎng)所需液量，常規(guī)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)或過夜，次日傳代。2. 短距離運(yùn)輸（幾小時(shí)）去掉大部分生長(zhǎng)液，僅留少量液體覆蓋單層細(xì)胞，防止細(xì)胞干燥，細(xì)胞面朝上。3. 細(xì)胞懸液空運(yùn) 將濃度為6X105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液于04C放置24h. 將細(xì)胞懸液混勻后，200r/min離心30min，棄

24、去含酶的上清液，加4C新鮮培養(yǎng)液，是細(xì)胞終濃度為X106個(gè)/ml。 將細(xì)胞裝于4C的冰盒內(nèi)空運(yùn)，到達(dá)目的地后以200r/min離心30min，棄去上清液，加新鮮培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為6X105個(gè)/ml，然后接種于培養(yǎng)瓶。4. 液氮咚存運(yùn)輸利用1L液氮罐或大號(hào)暖瓶裝液氮，將凍存細(xì)胞管移入液氮中，這樣可將細(xì)胞轉(zhuǎn)送到其他場(chǎng)所。第五章動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)一、名詞解釋動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是指在人式條件（除滿足培養(yǎng)過程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，還要進(jìn)行pH和溶解氧的最佳控制）下，在細(xì)胞生物工程反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。微載體：是指直徑在60250卩m能適用于巾壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠，一般是

25、由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。微載體細(xì)胞培養(yǎng)：是在培養(yǎng)液內(nèi)加入培養(yǎng)液及對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒一微載體，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著并呈單層生長(zhǎng)繁殖，通過持續(xù)攪動(dòng)（為避免剪切力對(duì)細(xì)胞質(zhì)的影響，攪拌速度一定要慢）使微載體始終保持懸浮狀態(tài)的培養(yǎng)方法。微囊化細(xì)胞培養(yǎng)方法：是指在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)以及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)：是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細(xì)血管”即中空纖維來為培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的事種大規(guī)模培養(yǎng)方法。二、填空題1、根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培養(yǎng)、貼

26、壁培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。2、在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，能為細(xì)胞提供貼附表面的培養(yǎng)目前主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細(xì)胞工廠和微載體等。3、制備固定化細(xì)胞的方法很多，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附法、包埋法和微囊化法。4、無(wú)論培養(yǎng)何種細(xì)胞，就操作方式而言，深層培養(yǎng)可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種發(fā)酵工藝。5、針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特性開發(fā)的攪拌式生物反應(yīng)器，主要有籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器等。6、用氣流代替不銹鋼葉片進(jìn)行攪拌，因而產(chǎn)生的剪切力相對(duì)溫和，對(duì)細(xì)胞損傷較小的生物反應(yīng)器是氣升式生物反應(yīng)器。三、問答題1、目前由動(dòng)物細(xì)

27、胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類？請(qǐng)分別列舉出23個(gè)產(chǎn)物。答：目前由動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)物包括：1.疫苗類：狂犬病疫苗、乙肝疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗等；2.多肽和蛋白質(zhì)類藥物：生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素-2和神經(jīng)因子等；3.免疫調(diào)節(jié)劑及單克隆抗體：干擾素、免疫球蛋白等。P942、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括哪些步驟？答：將組織切成碎片、用溶解蛋白質(zhì)的酶處理而得到單個(gè)細(xì)胞、離心收集細(xì)胞、將細(xì)胞植入培養(yǎng)基中培養(yǎng)、酶解培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞層、再接種到若干培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)3、什么是懸浮培養(yǎng)？懸浮培養(yǎng)有何缺點(diǎn)？答：懸浮培養(yǎng)是指讓細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生物增殖的培養(yǎng)方法。缺點(diǎn)：不能采用灌流培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞密度

28、較低，另外只有少數(shù)細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)。4、微載體的選擇有何要求？答：微載體：是指直徑在60250卩m能適用于巾壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠，一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。具體要求如下：1.微載體表面性質(zhì)要適于細(xì)胞附著、伸展和增殖；2.微載體材料沒有毒性，且不會(huì)與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不會(huì)吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分；3.微載體的密度一般為ml，以便換液和收獲；4.微載體直徑要盡可能小最好控制在60250卩m之間，要盡可能均一；5.要具有良好的光學(xué)透明性，以便觀察；6.能承受120C高溫；7.制作原料充分，價(jià)格便宜，制作簡(jiǎn)便，且經(jīng)適當(dāng)處理后能反復(fù)使用。5、微載體培養(yǎng)的操作包括哪些步驟？答：微載體培

29、養(yǎng)的操作包括五個(gè)階段：培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、微載體培養(yǎng)的放大階段。6、微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意哪些問題？答：微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意：溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過；膜應(yīng)有足夠的機(jī)械強(qiáng)度可抵抗培養(yǎng)中的攪拌。7、理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足基本要求？試比較教材所介紹的幾種生物反應(yīng)器各自的優(yōu)缺點(diǎn)。答：理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足：1.在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細(xì)胞生物及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物的合成；2.生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)要有比較好的傳質(zhì)、混合民及密閉的性能，既

30、能保證培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，又能避免一切外來污染；3.制造反應(yīng)器所用的各種材料要對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性；4.培養(yǎng)環(huán)境的各種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制，并且精度要高，以利于培養(yǎng)過程的檢測(cè)和調(diào)節(jié)；5.反應(yīng)器應(yīng)便于操作和維修。8、幾種生物反應(yīng)器各自的優(yōu)缺點(diǎn)的比較：第六章特殊細(xì)胞培養(yǎng)概要一、填空1. 為了促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，需要從表皮分離、培養(yǎng)液和基質(zhì)選擇、增減適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子等方面抑制微生物生長(zhǎng)。2. 上皮細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面需包被生長(zhǎng)基質(zhì)如膠原等。3. 在上皮細(xì)胞的實(shí)際培養(yǎng)中，常將DMEM和HamF12培養(yǎng)基按一定比例混合使用。4. 用于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本多為鼠腦皮質(zhì)毛細(xì)血管、牛主動(dòng)脈、牛腎上脂

31、皮質(zhì)毛細(xì)血管、人臍靜脈以及人皮膚和脂肪的毛細(xì)血管。5. 神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)底物需要經(jīng)過膠原或的特殊處理。6. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子、有絲分裂抑制劑（如阿糖胞苷、5-氟脫氧尿嘧啶）可以防止非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)，用于神經(jīng)元細(xì)胞的純化。7. 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程中常用的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子有胰島素、氫化可的松、雌激素。8. 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞主要取材部位為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的皮質(zhì)組織。9. 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)主要包括神經(jīng)元和的培養(yǎng)。10. 永生性也稱不死性，即在體外培養(yǎng)中細(xì)胞表現(xiàn)為可無(wú)限傳代而不凋亡。11. 侵襲性是腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)張性增殖行為,體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞仍持有這種性狀。二、判斷1、上皮細(xì)胞培養(yǎng)中使用的各種液體包括細(xì)胞凍存液、分離

32、液以及培養(yǎng)液都需要添加比其他組織培養(yǎng)濃度更高的抗生素。（0）2、神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)需要極高的營(yíng)養(yǎng)條件，一般以RPMI-1640與HamF12混合培養(yǎng)基（1:1，體積比）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。（X）3、人腫瘤細(xì)胞主要來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。（0）4、制備腫瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量選用退變組織。（X）5、干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。（X）6、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法是目前表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的較為成熟的技術(shù)。（X）三、簡(jiǎn)答題1、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性有哪些？ 永生性 形態(tài)和性狀 侵襲性 生長(zhǎng)增長(zhǎng) 細(xì)胞遺傳 異質(zhì)性2、應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行腫瘤研究具有的優(yōu)點(diǎn)。 可以免受機(jī)體內(nèi)部因素的影響，從而便于研究理化和生物因素對(duì)腫瘤細(xì)

33、胞生命活動(dòng)的影響 便于眼睛腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能 腫瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期保存以便于觀察其遺傳行為的改變 用于抗癌藥物的快速篩選3、常用的排除成纖維細(xì)胞的方法有哪些？簡(jiǎn)述其操作過程。機(jī)械刮除法、反復(fù)貼臂法、消除排除法機(jī)械刮除法：a.制備無(wú)菌刮頭b.標(biāo)記c.刮除d.用Hanks液沖洗一兩次，沖洗被刮掉的細(xì)胞e.注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止Hanks液反復(fù)貼臂法：a.細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出原瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，用以蛋白酶消化后，沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液b.取三個(gè)培養(yǎng)瓶，分別編號(hào)為A、B、C先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中，然后置溫箱中靜止培養(yǎng)520mi

34、n，取出并輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中在培養(yǎng)瓶的一個(gè)角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)接到B培養(yǎng)液中；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)520min后，按A瓶的處理方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中置溫箱中培養(yǎng)；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)機(jī)制溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第七章與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的部分實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、填空1. 制備單克隆抗體的融合是指將免疫小鼠的（脾細(xì)胞）和（小鼠骨髓瘤細(xì)胞）融合。2. 融合過程中使用的促溶劑主要是（聚乙二醇）。3. 第一個(gè)單克隆抗體是（1975）年制備成功的。4. 常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法有（磷酸鈣轉(zhuǎn)染）、（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）和（DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染）。5. 單克隆抗體的大量制備

35、普遍采用的方法是（雜交瘤技術(shù)）。其他參考答案：小鼠腹腔接種法6. 雜交瘤細(xì)胞克隆化的方法很多，常用的包括（有限稀釋法）和（軟瓊脂平板法）。7. 在細(xì)胞融合過程中瘤細(xì)胞株應(yīng)用最多的是（雜交瘤）細(xì)胞株。8. 細(xì)胞融合培養(yǎng)時(shí)加入在（HAT）選擇系統(tǒng)，目的是保證只有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。二、名詞解釋單克隆抗體：是由一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的只針對(duì)某一特定抗原決定簇的抗體分子。細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染：將外源性基因采用化學(xué)或物理的方法人工地導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，就叫做細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，又叫基因轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。三、判斷題1. 脂質(zhì)體法比磷酸鈣法轉(zhuǎn)染的效率高。（V）2. 促溶劑PEG的最適使用濃度為60%80%（X）3融合過程中PEG

36、作用細(xì)胞的時(shí)間通常以12min為宜。（V）4. 在單抗制備過程中可以采用任何品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。（X）四、簡(jiǎn)答題培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞的機(jī)理是什么？答：HAT培養(yǎng)基是含次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）及氨基蝶呤（A）的一種選擇培養(yǎng)基，這三種成分均與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。A可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA細(xì)胞在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DNA這時(shí)正常細(xì)胞可以通過“補(bǔ)救途徑”，由TK和HGPR酶利用T和H合成核酸而繁殖。瘤細(xì)胞是HGPRT!陰性細(xì)胞，自身不能通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA而繁殖。B細(xì)胞雖含有HGPRT但在體外培養(yǎng)只存活57d。融合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）含有B細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中

37、瘤細(xì)胞能利用B細(xì)胞的HGPRT酶通過補(bǔ)救途徑合成DNA而繁殖。因此在HAT培養(yǎng)基中，HGPRT或TK瘤細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡，只有融合成功的雜交瘤存活。2. 骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合過程中應(yīng)特別注意的幾個(gè)問題是什么？答：（1）細(xì)胞比例。骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例可從1：2到1:10不等，常用1:5到1:10之間的比例。（2）反應(yīng)時(shí)間。各個(gè)步驟都需在規(guī)定的時(shí)間下嚴(yán)格操作。（3）反應(yīng)溫度。整個(gè)融合過程都要在37°C的水浴中進(jìn)行，所需試劑要在37°C預(yù)熱。（4）PEG的選擇。相對(duì)分子質(zhì)量為10006000的PEG均可用，分子量越大，毒性越強(qiáng)，單分子量過小，又影響融合效果。3.

38、單克隆抗體和多克隆抗體有何區(qū)別？答：如果用經(jīng)免疫過的動(dòng)物的脾細(xì)胞獲得雜交瘤細(xì)胞，則得到單克隆抗體，如果用動(dòng)物的血清，則得到多克隆抗體。單抗是有單個(gè)細(xì)胞起源的細(xì)胞克隆分泌的，所以只針對(duì)蛋白抗原的單一抗原決定簇，而多抗是有多個(gè)不同克隆的B細(xì)胞產(chǎn)生的，是多種細(xì)胞的混合物，但其中的每一種抗體也只是針對(duì)一種決定簇。多克隆抗體純度較低、特異性較差、易引起交叉反應(yīng)和過敏反應(yīng)，且產(chǎn)量有限。單克隆抗體性質(zhì)純、效價(jià)高、特異性強(qiáng)，可以避免交叉反應(yīng)，提高了抗原一抗體反應(yīng)的敏感性和特異性。第八章植物細(xì)胞培養(yǎng)概論一、名詞解釋外植體：在植物組織培養(yǎng)中由活體植物上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無(wú)菌細(xì)胞、組織、器官等，稱為外植體

39、。愈傷組織：指在人工培養(yǎng)基上，由外植體的表面形成的一團(tuán)不定形的排列疏松的薄壁細(xì)胞。脫分化：指在植物組織細(xì)胞培養(yǎng)中，一個(gè)成熟細(xì)胞或已分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只癄顟B(tài)的過程。細(xì)胞全能性：每個(gè)細(xì)胞都攜帶著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株或個(gè)體的潛在能力。二、判斷題1. 愈傷組織是脫分化的植物組織細(xì)胞。（F）2. 在植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)中都包含愈傷組織培養(yǎng)。（T）3. 植物細(xì)胞培養(yǎng)的主要目的是獲得所需的細(xì)胞和各種所需的產(chǎn)物。（T）三、填空1、外植體經(jīng)自來水沖洗后應(yīng)進(jìn)行（浸潤(rùn)滅菌、滅菌劑處理、無(wú)菌水刷洗）三步，完成滅菌過程。2、植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性3、1943年，（White）正式

40、提出植物細(xì)胞全能性理論，認(rèn)為每個(gè)植物細(xì)胞具有母株植物的全套遺傳信息，具有發(fā)育成完整植株的能力。4、植物生長(zhǎng)點(diǎn)附近的病毒濃度很低甚至無(wú)病毒，利用（莖尖分生）組織培養(yǎng)可脫去病毒，獲得脫毒植株。5、用于外植體表面滅菌的滅菌劑主要有（次氯酸鈣）、（過氧化氫）、（氧化汞）等。四、問答題1、植物細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的不同體現(xiàn)在哪些方面？答：培養(yǎng)對(duì)象不同：一般來說，以各種植物的器官和組織，如根、莖、葉、花、未熟的果實(shí)、種子、愈傷組織等為培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)技術(shù)屬于植物組織培養(yǎng)；而以各種形式的植物細(xì)胞，如脫分化的薄壁細(xì)胞（愈傷組織）、單細(xì)胞、單倍體細(xì)胞、原生質(zhì)體、小細(xì)胞團(tuán)、固定化細(xì)胞等為培養(yǎng)對(duì)象的培養(yǎng)技術(shù)屬于植物

41、細(xì)胞培養(yǎng)。愈傷組織培養(yǎng)既屬于組織培養(yǎng)又屬于細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)目的不同：植物組織培養(yǎng)的主要目的是獲得所需的植物組織和再生植株，還可以生產(chǎn)某些次級(jí)代謝物，在名貴花、木、瓜、果種苗（試管苗）的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、種苗的脫毒、植物的大規(guī)模快速繁殖等方面具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值；而植物細(xì)胞培養(yǎng)的主要目的是獲得所需的細(xì)胞和各種所需的產(chǎn)物，也可以利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物，還可以利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行種質(zhì)保存、人工種子的制備和植株的大規(guī)?？焖俜敝车取?、植物細(xì)胞培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)方面有哪些應(yīng)用？答：在植物育種方面的應(yīng)用：（1）單倍體育種：通過花藥（花粉）培養(yǎng)獲得單倍體植株，然后通過秋水仙素處理使其染

42、色體加倍，可以迅速使后代基因型純和，加速育種進(jìn)程。（2）胚培養(yǎng)：采用幼胚（或胚胎、胚珠等）離體培養(yǎng)使自然條件下早熟的幼胚發(fā)育成熟，獲得雜種后代。（3）體細(xì)胞雜交：體細(xì)胞雜交是打破物種間生殖隔離，實(shí)現(xiàn)其有益基因的交流，改良植物品種，以達(dá)到創(chuàng)造植物新類型的有效途徑。（4）細(xì)胞突變體的誘變與篩選：在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物的細(xì)胞處于不斷分裂的狀態(tài)，易受培養(yǎng)條件和外界壓力的影響而發(fā)生變異。（5）遺傳轉(zhuǎn)化：可以獲得抗逆，高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株，能解決植物育種中用常規(guī)雜交方法所不能解決的問題，并能與常規(guī)育種方法相結(jié)合，建立高效育種技術(shù)體系。 在植物脫毒方面的應(yīng)用：許多植物，特別是無(wú)性繁殖植物均受到多種病毒的侵染

43、，造成嚴(yán)重的品種退化，產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，利用莖尖分生組織培養(yǎng)可脫去病毒，獲得脫毒植株。 在離體快繁方面的應(yīng)用：傳統(tǒng)的植物繁殖是在田間或在溫室中進(jìn)行有性繁殖或無(wú)性繁殖，效率低，時(shí)間長(zhǎng)，不利于優(yōu)良品種和新品種的大規(guī)模推廣應(yīng)用。由于植物離體繁殖快速，而且材料來源單一，遺傳背景均一，不受季節(jié)和地區(qū)等的限制，重復(fù)性好，離體快繁比常規(guī)方法快數(shù)萬(wàn)倍至百萬(wàn)倍。 在植物種質(zhì)資源保存方面的應(yīng)用：利用植物細(xì)胞繼代培養(yǎng)或者冷凍保存的方法進(jìn)行種質(zhì)保存，不僅簡(jiǎn)單方便，而且可以使植物的遺傳特性得以長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存，對(duì)于稀有植物品種、優(yōu)良植物品種和新型植物品種的種質(zhì)保存具有重要的意義。同時(shí)，離體保存的材料不受各種病蟲害侵染，

44、而且不受季節(jié)的限制，所以利于種質(zhì)資源的地區(qū)間及國(guó)際間的交換。3、外植體的清洗和滅菌如何操作？答：可應(yīng)用70%酒精和一定濃度的次氯酸鈉溶液來滅菌外植體，其方法如下： 材料的選取與清洗1 ）選擇無(wú)菌斑和蟲害的植株作為母株。2 ）剪取所需葉片、莖段（23厘米）及根等材料，在自來水下沖洗掉泥土等雜物。3 ）在加有洗潔精的水中清洗材料，并用自來水沖洗干凈，分裝如干凈的三角燒瓶中，備用。 滅菌（在超凈工作臺(tái)上操作）1 ）在裝有材料的三角瓶中加入70%酒精至浸沒材料，12分鐘（可根據(jù)材料經(jīng)試驗(yàn)而定）后迅速倒掉酒精。2 ）在裝有材料的瓶中加入6%20%的安替福明溶液530分鐘（濃度和時(shí)間可根據(jù)材料經(jīng)試驗(yàn)而定）

45、，在此過程中不斷搖晃三角瓶并用火焰燒瓶口數(shù)次。3 ）在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將材料沖洗至少三次，即可。第九章植物細(xì)胞培養(yǎng)的條件、選擇題1. 接種工具滅菌常采用（A）A.灼燒B.高壓C.過濾D.熏蒸2. 具有促進(jìn)愈傷組織生產(chǎn)的物質(zhì)是（B）A.維生素PPB.維生素BC.維生素B6D.甘氨酸3. 微量元素母液的配制濃度（B）倍倍mlml4. 配制10倍大量元素母液，所需硝酸銨（C）mg.3700C5.配制100倍有機(jī)物母液時(shí)，所需維生素B（B）mgA.0.4.10C（A）A.維生素B2B.維生素B1C.維生素Bo7.下列哪種激素不屬于生長(zhǎng)素類（C）F列哪種不是組織培養(yǎng)常用的維生素D.維生素C8.下面哪

46、種是MS培養(yǎng)基大量元素所用藥劑（AA.硫酸鎂B.硫酸亞鐵C.硫酸鋅二、判斷題培養(yǎng)基是沒有激素的培養(yǎng)基。2. 鐵鹽母液可配成100倍液，配制培養(yǎng)基時(shí)移取3. 瓊脂只起固化作用，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。三、填空1. 培養(yǎng)基PH般調(diào)節(jié)為二，常用HC_和NaOH方法來進(jìn)行。2. 磷是構(gòu)成蛋白質(zhì)及核酸的主要成分，這種物質(zhì)又是細(xì)胞膜、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP的成分，這是一種常見的直接能量物質(zhì)。微量元素母液可配成100倍，配制培養(yǎng)基時(shí)移取高壓滅菌可以對(duì)培養(yǎng)基及蒸餾水、玻璃器皿、鑷子等進(jìn)行滅菌。放冷氣時(shí)壓力表指示為JMPa，在時(shí)鍋內(nèi)溫度為121C。四、問答題1.植物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本設(shè)備有哪些？答：高

47、壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)架、酸度計(jì)、天平、低溫低速臺(tái)式離心機(jī)、倒置顯微鏡、雙筒解剖鏡、生物顯微鏡、水浴鍋、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架和搖床、蒸餾水發(fā)生器或去離子水裝置、培養(yǎng)箱、超聲波清洗洗器。養(yǎng)基3.4.5.D.硫酸銅(F100ml。）（F）（T）10ml。2. 植物細(xì)胞培養(yǎng)基本成分有哪幾大類？各類試劑在保存方法上有何要求？答：植物細(xì)胞培養(yǎng)基的主要萬(wàn)分包括水、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)成分、抗生素等。大量元素母液的保存方法是保存于4C冰箱中；微量元素母液的保存方法是保存于冰箱中；鐵鹽母液的保存方法是儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中，并保存于冰箱中；有機(jī)物母液的保存方法是保存于冰箱中；植物激素母液的保存方法是保存于冰箱。3. 細(xì)胞培

48、養(yǎng)中，常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有哪幾類？它們的主要功能是什么？答：細(xì)胞培養(yǎng)中常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要分五大類；具體如下：生長(zhǎng)素，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，促進(jìn)生根；細(xì)胞分裂素，主要功能是誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，抑制根的分化；赤霉素，能刺激在培養(yǎng)基中形成的不定胚正常發(fā)育成小植株；脫落酸，能夠促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率，促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的成熟，減少機(jī)型胚胎發(fā)生；其他類激素，例如乙烯，它能夠促進(jìn)果實(shí)成熟、脫葉、發(fā)芽以及根和苗的生長(zhǎng)等。4. 配制植物細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)為什么要配制母液？如何配制培養(yǎng)基的各種母液？對(duì)各種母液濃縮的倍數(shù)有何要求？答：為使用方便和用量

49、準(zhǔn)確，配制培養(yǎng)基前常要配制母液。各種母液的配制方法如下：大量母液，按照配方用量，各種化合物擴(kuò)大10倍稱取后，蒸餾水溶解混合并定容至1000ml； 微量元素，按配方用量100倍，蒸餾水溶解、稍加熱，按一定順序混合并定容至1000ml； 鐵鹽母液，分別稱取一定量硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉配成100倍濃度螯合態(tài)鐵鹽混合冷卻定容至1000ml;有機(jī)物質(zhì)母液，按配方用量100倍分別稱取，溶解后定容至100ml；植物激素母液，一般配制濃度2mg/ml。生長(zhǎng)素類（IAA、NAAIBA）NAOH或酒精溶解后定容所需體積。細(xì)胞分裂素類（KT、6BA）少量HCL加熱溶解后加水定容。5. 配制鐵鹽母液有何特殊要求？

50、為什么？答：一般用硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉配成100倍濃度的螯合態(tài)鐵鹽比較穩(wěn)定，因此需要單獨(dú)配制。因?yàn)殍F鹽容易沉淀。6. 常用的培養(yǎng)基滅菌方法有哪幾種？如何選擇？答：常用的培養(yǎng)基滅菌方法有高壓蒸汽滅菌和過濾滅菌兩種。當(dāng)培養(yǎng)基的所有成分都是對(duì)熱穩(wěn)定的時(shí)，應(yīng)選擇高壓蒸汽滅菌。而當(dāng)培養(yǎng)基中包含熱不穩(wěn)定的成分時(shí)，應(yīng)選擇過濾滅菌。第十章植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程和方法一、名詞解釋外植體：指從植物體上取出的用于無(wú)菌培養(yǎng)或直接分離細(xì)胞的部分植物組或器官。脫分化：已經(jīng)分化的植物器官、組織或細(xì)胞，當(dāng)受到創(chuàng)傷或進(jìn)行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時(shí)，已停止分裂的細(xì)胞，又重新恢復(fù)分裂，細(xì)胞改變?cè)械姆只癄顟B(tài)，失去原有結(jié)構(gòu)和功能

51、，成為具有未分化特性的細(xì)胞。愈傷組織：植物各種器官的外植體在離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞經(jīng)脫分化等一系列生理生化過程，改變?cè)械奶匦岳^而轉(zhuǎn)變形成一種能夠迅速增殖的無(wú)特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán)，稱為愈傷組織。懸浮培養(yǎng):指的是一種在受到不斷攪動(dòng)或搖動(dòng)的液體里培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。通過懸浮培養(yǎng)能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。固定化培養(yǎng)：固定化細(xì)胞是指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。以這種方式進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)叫做細(xì)胞固定化培養(yǎng)。單細(xì)胞培養(yǎng)：是指從植物器官、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)液中游離出單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的一門技術(shù)。植板率：是指通過平板培養(yǎng)

52、后形成細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞數(shù)與接種細(xì)胞總數(shù)的比值。原生質(zhì)體：是指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。二、填空1、請(qǐng)列出外植體常用的五種消毒劑：氯化汞（升汞）、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、酒精。2、愈傷組織的形成分為起始期、分裂期、形成期三個(gè)時(shí)期。3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化方法有體積選擇法、低溫處理法、饑餓法、抑制法。4、植物細(xì)胞固定化的方法有：吸附法、包埋法。5、植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法有看護(hù)培養(yǎng)法、微室培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法、條件培養(yǎng)法。6、原生質(zhì)體純化方法有沉降法、漂浮法、不連續(xù)梯度法。三、判斷1、在選擇組織培養(yǎng)材料時(shí)，季節(jié)對(duì)外植體無(wú)明顯影響。（X）2、單細(xì)胞平板培養(yǎng)的效率是通過植板率來反

53、映的。（V）3、植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)可適用于各種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。（X）4、原生質(zhì)體多在鹽溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（X）5、原生質(zhì)體分離常用的酶種類有纖維素酶類、果膠酶類、蝸牛酶和胼胝酶等。（V）四、簡(jiǎn)答題1、簡(jiǎn)述植物外植體選擇的基本原則。用于直接分離植物細(xì)胞的外植體，必須選擇適當(dāng)生長(zhǎng)期的健康植株，并選擇細(xì)胞間粘連程度小的植物組織、器官。2、植物細(xì)胞獲取的方法有哪些？從外植體直接分離植物細(xì)胞通過愈傷組織誘導(dǎo)獲取植物細(xì)胞3、簡(jiǎn)述愈傷組織形態(tài)發(fā)生的途徑。a）起始期，又稱誘導(dǎo)期，是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。這個(gè)時(shí)期的細(xì)胞大小無(wú)明顯變化，細(xì)胞內(nèi)RNA含量迅速明顯增加，細(xì)胞核變大，酶活力相應(yīng)產(chǎn)生

54、變化等。b）分裂期，經(jīng)過誘導(dǎo)期之后，外植體外層細(xì)胞開始迅速分裂，進(jìn)入分裂期。這一時(shí)期由于細(xì)胞分裂的速度大大超過細(xì)胞伸展的速度，細(xì)胞體積迅速變小，逐漸回復(fù)到分生狀態(tài)。在這個(gè)過程中細(xì)胞分裂進(jìn)入最旺盛時(shí)期，細(xì)胞數(shù)目迅速增加，細(xì)胞體積小，細(xì)胞內(nèi)無(wú)大液泡，細(xì)胞核和核仁較大，RNA含量最高，DNA的含量基本保持不變。c）形成期，形成期是經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期之后形成愈傷組織的時(shí)期。這個(gè)時(shí)期的特征是細(xì)胞大小趨于穩(wěn)定，細(xì)胞分裂以從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主向以內(nèi)部較深的細(xì)胞分裂為主，隨著愈傷組織表層細(xì)胞分裂的減緩和停止，內(nèi)部深處的細(xì)胞開始分裂并形成像微管束或類似分生組織的鳥巢狀結(jié)構(gòu)。4、一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？對(duì)于用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？1. 懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在3050個(gè)細(xì)胞以下。2. 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。3. 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般23天便可增加一倍。5、為什么要進(jìn)行植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)？雖然細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物，但是人們所期待的次生代謝產(chǎn)物往往產(chǎn)量不高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，密集而有一定分化的，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞培養(yǎng)物，能比分散而無(wú)結(jié)構(gòu)的、生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞培養(yǎng)物積累更多的目的次生代謝物。細(xì)胞固定化后的密集而緩慢