基因工程第三章克隆載體-1匯總

1、1/32計劃學時: 4h 第一節(jié) 質粒載體 (plasmid vector) 第二節(jié) 病毒載體(virus vector) 第三節(jié) 染色體定位整合載體(chromosome position fixing vectors) 第四節(jié) 酵母人工染色體載體 (YAC vector) 第五節(jié) 特殊用途的載體2/32 通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子。3/32有多克隆位點有多克隆位點,供外源供外源DNA插入。插入。 多克隆位點多克隆位點(multiple cloning site, polylinker): 具有多個限制酶的識別序列具有多個限制酶的識別序列,

2、可供可供處源處源DNA片段插入片段插入.攜帶外源攜帶外源DNA進入受體細胞進入受體細胞(receptor cell, host cell)，并能自我復制。，并能自我復制。有選擇標記基因有選擇標記基因(marker gene),例如：抗抗生素例如：抗抗生素基因?；颉］d體要安全，對受體安全，不能轉入其他生物，載體要安全，對受體安全，不能轉入其他生物，尤其人細胞。尤其人細胞。4/32The essential nucleotide sequences of cloning vectors: A replication origin, A drug-resistance gene, 1. Multi

3、ple cloning sites. 復制起始位點抗氨芐青霉素基因多克隆位點5/32第一節(jié)第一節(jié) 質粒質粒 Plasmid1.1 定義v細菌染色體之外的能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。 v Circular, double-stranded DNA (dsDNA) that are separated from the chromosomal DNA in bacteria. 1 質粒的特點質粒的特點6/32質粒載體 (Plasmid vector):以質粒DNA分子為基礎構建(construct)而成的克隆載體。構型構型: 超螺旋超螺旋 supercoilRelaxed DNASuperco

4、il DNA7/321.2 質粒的大小質粒的大小l天然質粒天然質粒:1kb100kb l質粒載體較小質粒載體較小, 有的只有有的只有3kb, 具有作為載體的具有作為載體的必須序列即可。必須序列即可。200kb3kb8/32 每次細胞分裂，質粒均可復制傳給子代每次細胞分裂，質粒均可復制傳給子代細胞。細胞。 一般，細胞中質粒的拷貝數(shù)保持穩(wěn)定。一般，細胞中質粒的拷貝數(shù)保持穩(wěn)定。9/32 松馳型質粒：拷貝數(shù)多，小質粒。松馳型質粒：拷貝數(shù)多，小質粒。 嚴緊型質粒：拷貝數(shù)少，大質粒。嚴緊型質粒：拷貝數(shù)少，大質粒。200kb5kb 10/32 能寓于同一細胞的質粒為親合性質粒能寓于同一細胞的質粒為親合性質粒

5、 不能寓于同一細胞的質粒為不親合性質粒。不能寓于同一細胞的質粒為不親合性質粒。布什 本.拉登布什 布萊爾 受體細胞最好無內(nèi)源質粒受體細胞最好無內(nèi)源質粒.11/32 接合質粒：接合質粒：含有含有 tra基因，可連接宿主細胞和受體基因，可連接宿主細胞和受體細胞，并在兩者間轉移。細胞，并在兩者間轉移。 特點特點: 大，拷貝數(shù)少，宿主多，不安全。大，拷貝數(shù)少，宿主多，不安全。 非接合質粒：非接合質粒：無無tra基因，基因， 特點特點: 小，拷貝多，宿主少，安全，常用載體。小，拷貝多，宿主少，安全，常用載體。接合質粒接合質粒染色體染色體12/32 隱蔽質粒：引入后，受體細胞的遺傳特性無隱蔽質粒：引入后，

6、受體細胞的遺傳特性無變化。變化。 顯性質粒：引入后，為受體細胞提供了新的顯性質粒：引入后，為受體細胞提供了新的遺傳特性。遺傳特性。 如：抗抗生素，顏色變化等。如：抗抗生素，顏色變化等。13/322.1 選擇合適的出發(fā)質粒，并用限制酶切開。選擇合適的出發(fā)質粒，并用限制酶切開。好的質粒應具備：好的質粒應具備： 復制起始位點（復制起始位點（Replication Origin，Ori）標記基因（標記基因（Marker gene ） 多克隆位點（多克隆位點（Multiple cloning site ）啟動子（啟動子（Promoter ）終止子（終止子（Terminator） 14/32多克隆位點標記

7、基因Ori啟動子終止子EcoRI合適的質粒合適的質粒15/322.2 獲得合適的DNA片段. vDNA也要用限制酶切開，有兩個粘性末端。v易于DNA ligase連接. 16/322.3、重組連接v混合酶切后的DNA片段和載體，加入DNA ligase催化連接。17/32質?？寺?018/32 Ti 質粒質粒: 農(nóng)桿菌中可引起寄主產(chǎn)生腫瘤的質粒。農(nóng)桿菌中可引起寄主產(chǎn)生腫瘤的質粒。 Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)19/32（4個功能區(qū)）（1）T-DNA Ti質粒中能轉移進入植物細胞內(nèi)的DN

8、A片段。長約20kb， 包含冠癭堿合成和冠癭瘤生長基因20/32T-DNA的結構特征： T-DNA區(qū)兩端具有25個堿基對的順向重復序列稱為邊界序列。21/32右邊界序列更重要。去除右邊界序列，將使T-DNA失去轉移和整合的功能；左邊界的缺失，對無明顯影響。22/32Left borderright border 只要保留邊界序列， T-DNA的其它序列被外源DNA片段替換，仍可轉入植物基因組。23/32 （2） VirVir區(qū)區(qū): :位于T-DNA上游的一組基因，可引起T-DNA的轉移，長度約35kb （3） ConCon區(qū)：區(qū)：含有與農(nóng)桿菌之間接合轉移有關的基因（tra），使Ti質粒在細菌間

9、轉移。 （4） OriOri區(qū)：復制起始區(qū)區(qū)：復制起始區(qū). .24/32Left borderright borderLeft borderright borderVir regionCon regionOri region25/32 農(nóng)桿菌感染后，植物細胞接受刺激釋放信號分子，農(nóng)桿菌感染后，植物細胞接受刺激釋放信號分子，反過來激活農(nóng)桿菌反過來激活農(nóng)桿菌TiTi質粒上的質粒上的virvir基因；基因； 農(nóng)桿菌粘附到植物細胞壁。農(nóng)桿菌粘附到植物細胞壁。 植物激素誘導植物激素誘導virvir基因表達，其表達產(chǎn)物引起基因表達，其表達產(chǎn)物引起T-T-DNADNA脫離質粒脫離質粒 并位移進入植物細胞中并

10、位移進入植物細胞中, ,進入植物細胞的進入植物細胞的T-DNAT-DNA整整合并表達。合并表達。26/32Left borderright border 構建構建Ti質粒克隆載體不是真正用于農(nóng)桿菌，質?？寺≥d體不是真正用于農(nóng)桿菌，而是用于植物，農(nóng)桿菌起介導作用。而是用于植物，農(nóng)桿菌起介導作用。27/32l共整合載體法：共整合載體法：l將目的基因克隆引入常規(guī)質粒，在目的基因兩側分別引入T-DNA左右邊界.l轉入農(nóng)桿菌，經(jīng)內(nèi)同源重組，將目的基因整合到農(nóng)桿菌的T-DNA區(qū)，l再轉化植物。28/32Bacteria celltransfer同源重組共整合載體法plasmidLeft borderrig

11、ht borderAim geneplant cellTi plasmidInfect plant cell29/32l 二元載體法二元載體法l 利用利用Vir區(qū)和區(qū)和T-DNA區(qū)（具區(qū)（具T borders）分）分別構建兩個質粒，并轉入農(nóng)桿菌。別構建兩個質粒，并轉入農(nóng)桿菌。l Vir區(qū)基因群反式作用，將含外源基因的區(qū)基因群反式作用，將含外源基因的T-DNA轉入植物染色體。轉入植物染色體。30/32plant cellChromosome DNAChromosome DNABacteria cellInfect planttransferplasmidPlasmid-1Plasmid-1plasmidright borderLeft borderAim